1.4. Ифа, характеристика, варианты, практическое применение.

В основе реакций лежит специфическое взаимодействие антигена с антителом, при котором один из компонентов реакции метится ферментом. После образования комплекса антиген – антитело добавляют субстрат и по расщеплению субстрата ферментной меткой судят о реакции.

Ферментные метки – это белковые молекулы, обладающие мощным каталитическим действием.

Наиболее часто в качестве каталитических меток используют пероксидазу, щелочную фосфатазу, глюкозоксидазу.

В качестве субстратов для ферментов применяются: перекись водорода, пара – нитрофенилфосфат и др.

Под действием ферментов субстрат расщепляется, изменяя цвет индикатора. Это регистрируется визуально и фотокалориметрически.

На сегодняшний день известно большое количество вариантов ИФА. Наиболее широкое применение на практике нашел вариант твердофазного ИФА. Суть его в том, что один из компонентов реакции фиксируется в жидкой фазе. С помощью промывания легко отделить образующийся комплекс антиген – антитело от несвязавшихся компонентов. В качестве твердых носителей используются панели, шарики, пробирки, изготовленные из синтетических инертных материалов: полистирола, дакрила, метакрила, поливинилхлорида и др.

* Практическое применение: серодиагностика и сероидентификация.

В зависимости от применяемой модификации ИФА различают следующие варианты методов: прямой, непрямой, конкурентный.

Прямой ИФА: («сэндвич» метод) (сероидентификация)

* Компоненты:

1. Исследуемый материал, содержащий антигены;

2. Диагностическая специфическая иммунная сыворотка, предварительно фиксированная на твердой фазе;

3. Диагностическая специфическая иммунная сыворотка, меченая ферментом.

+

АТ – 1 АГ неизв.

диагн. исслед.

иммун. мат.

сыворотка

Непрямой ИФА: (серодиагностика)

* Компоненты:

1. Неизвестная исследуемая сыворотка.

2. Диагностикум или антиген, предварительно фиксированный на твердой фазе.

3. Антиглобулиновая сыворотка, меченая ферментом. Содержит кроличьи антитела и иммуноглобулин человека.

* Методика постановки:

Конкурентный ИФА:

Основан на конкуренции известного и анализируемого антигенов за участки связывания с антителом, аналогично как и конкурентный вариант РИА. Интенсивность реакции определяется фотометрически (на фотоколориметрах или спектрофотометрах по изменению цвета индикатора).

1. на твердой фазе сорбируют антитела;

2. добавляют неизвестный антиген (биологическую жидкость) и меченый антиген, который конкурирует с антигеном в испытуемой пробе за иммобилизированные антитела.

• Ферментативная активность на твердой фазе оказывается обратно пропорциональна концентрации определяемого в пробе антигенами.

Ингибиторный ИФА:

1. на твердой фазе иммобилизируют антиген;

2. определяемый антиген в испытуемой пробе конкурирует с иммунными антигенами за растворимые антитела.

• Ферментативная активность измеряемая на твердой фазе, обратно пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе.

Иммунометрический анализ.

1. к испытываемой пробе, содержащей антиген добавляют заведомый избыток меченных антител;

2. к смеси добавляют заведомый избыток иммунного на твердой фазе антигена;

3. после инкубации отделяют растворимую фракцию и в ней измеряют ферментативную активность.

• Ферментативная активность - прямо пропорциональна содержанию антигена в испытуемой биопробе.

Метод более чувствителен, чем конкурентный ИФА.

٭ Наиболее часто в качестве ферментативных меток используются:

1. пероксидаза из корней хрена (субстрат: ортофенилендиамин, 3,3-диаминобензидин);

2. β-галактозидаза (с:4-метилбелиферил-β-Д-галактозин);

3. щелочная фосфотаза (с:5-бромо-4-хлоро-3-индомифосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, р-нитрофенил фосфат);

4. уреаза (с: мочевина с бромкрезолом пурпурным).

Иммуноферментный метод с применением иммуносорбента.

Метод выявления антител или антигена, при котором фермент используется в качестве носителя. Интенсивность преобразования субстрата пропорциональна содержанию фермента и концентрации искомого компонента.

Свободный антиген и антиген с ферментом конкурируют за рецепторные зоны антител. При недостатке свободного антигена в тестируемом растворе все антитела связывает антиген с ферментом.

* Преимущества ИФА:

1. Универсальность; позволяет определять любое соединение, против которого получены специфические антитела.

2. Высокая чувствительность и специфичность.

3. Простота и доступность, не требует специальной аппаратуры.

4. Меченые соединения устойчивы и сохраняют свою специфическую активность при длительном хранении.

5. В отличие от РИА отсутствует радиационная опасность.

6. Возможно количественное определение компонентов реакции.

* Недостатки:

1. Не дает точного ответа, если в исследуемом материале есть аналогичные метки – ферменты.

2. Требует высокоочищенных ингредиентов реакции.

*Практическое применение: для определения концентрации гормонов, лекарственных веществ, для сероидентификации и серодиагностики многих инфекционных заболеваний.

Иммуноанализ, где в качестве метки используют ферменты, получил сокращенное название ELISA (ensime liked immunosorbent allasay) – ферментзависимый иммуносорбционный анализ.