Кировская государственная медицинская академия Кафедра микробиологии и вирусологии

Тема: “Реакции с использованием меченых антигенов или антител. Иммуноблотинг.’’

Методические указания:

1. Общая характеристика реакций с использованием меченых антигенов и антител.

В настоящее время широкое применение получили серологические реакции, в которых участвуют меченые антигены и антитела. К этим реакциям относятся:

1. РИФ - реакция иммунофлюоресценции;

2. ИФА – иммуноферментный анализ;

3. РИА – радиоиммунный анализ.

В этих реакциях используются разные метки и разные методики определения этих меток. Введения меток не влияет на свойства антигенов и антител.

Таблица 1. Общая характеристика реакций с использованием меченых антигенов и антител.

Названия реакций	Метка	Выявление метки
1. РИФ	Флюорохромы: родамин, В – изотиоционин, фитц	С помощью люминисцентного микроскопа
2. РИА	Радиоактивные изотопы, J135 и др.	По изменению радиоактивности с помощью счетчиков
3. ИФА	Ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза	По действию на субстрат и изменению цвета индикатора фотометрически или визуально

По своей чувствительности и специфичности они превосходят реакции агглютинации, преципитации.

1.2. Риф, характеристика метода, варианты, применение.

В основе реакции лежит специфическое взаимодействие антигена с антителом, при котором один из компонентов реакции (чаще антитело) ковалентно связан с флюоресцентным красителем (флюорохромом). При этом образуются иммунные комплексы, которые светятся при люминесцентной микроскопии. В качестве флюорохромов используются: родамин, В – изотиоционин, флюоресцеинизотиоционат (фитц) и др.

На практике используется прямой и непрямой иммунофлюоресцентные методы.

Прямая РИФ: (Кунс, 1942 – 1950 гг.)

Определение: специфическое взаимодействие антигенов с антителами, один из которых несет флюоресцентную метку, приводящее к образованию светящегося комплекса АГ+АТ, видимого в флюоресцентном микроскопе.

*Компоненты:

применение - сероидентификация

1.Микробные антигены – исследуемый материал – в тканях или патологическом материале.

2. Специфические иммунофлюоресцентные сыворотки (АТ в рабочем титре).

*Методика постановки:

1. Приготовление мазка – отпечатка на стекле из исследуемого материала, содержащего антигены.

2. Обработка его специфической иммунофлюоресцентной сывороткой.

3. Отмывка то несвязавшихся меченых антител.

4. Микроскопия в люминесцентном микроскопе.

*Достоинства:

• простота, быстрота

• высокая специфичность.

*Недостатки:

• необходимо иметь большой набор люминесцирующих иммунных сывороток против каждого вида возбудителей, что трудно осуществимо на практике.

Непрямая РИФ:

Определение: специфическое взаимодействие антигенов с антителами и антиглобулиновыми антителами, меченными флюорохромом, приводящее к образованию светящегося комплекса, видимого в люминесцентный микроскоп.

*Компоненты:

Применение: - сероидентификация

- серодиагностика

1. Микробные антигены в тканях или патологическом материале;

2. Специфические иммунные сыворотки (кроличьи);

3. Антиглобулиновая флюоресцирующая сыворотка. Содержит антитела против кроличьих иммуноглобулинов.

*Методика постановки:

1. Мазок - отпечаток на стекле из исследуемого материала, содержащего антигены.

2. Обработка его специфической иммунной сывороткой.

3. Отмывка от несвязавшихся антител.

4. Обработка антиглобулиновой флюоресцирующей сывороткой.

5. Отмывка от несвязавшихся меченых антител.

6. Микроскопия в люминисцентном микроскопе.

*Достоинства:

• быстрота

• высокая специфичность и чувствительность

• доступность, т. к. необходимо иметь только одну люминесцирующую антиглобулиновую сыворотку.

*Недостатки:

• короткий срок хранения сывороток

• дороговизна

*Практическое применение:

Экспресс – метод для обнаружения и идентификации многих бактериальных и вирусных антигенов (реже антител).

РИФ в «притертом» препарате для быстрой индикации патогенных бактерий.

Принцип: соединение антигена со специфическими флюоресцирующими антителами осуществляется в капиллярном пространстве, благодаря этому происходит более активное и быстрое взаимодействие между специфическими реагентами.

Методика:

1. на обезжиренное предметное стекло готовят тонкий мазок; фиксируют;

2. покровное стекло накладывают на мазок и быстро притирают к предметному стеклу;

3. под край притертого покровного стекла при помощи пастеровской пипетки вводят флюоросцентный иммуноглобулин;

4. для снижения флюоресцентного фона и повышения контрастности вводят капельку неполярной и нефлюоресцентной жидкости (диметилфталата), которая устраняет не специфичность флюоресцентного фона;

5. микроскопия под люминисцентным микроскопом.

Достоинства:

1. высокая чувствительность;

2. быстрота (5-7 мин.).

Недостатки:

Необходимо иметь большой набор люминисцирующих иммунных сывороток против каждого вида возбудителей.

РИФ с применением бумажных дисков (Никитин, 1964)

Определение: специфическое взаимодействие антигенов с антителами, один из которых несёт флюоросцентную метку, приводящее к образованию светящегося комплекса, – антиген + антитела – видимого в люминисцентном микроскопе.

Компоненты:

1. микробные антигены - исследуемый материал;

2) бумажные диски, пропитанные флюоросцентным иммуноглобулином.

Прямой метод:

1. на фиксируемый бактериальный мазок накладывают диск, на который наносят физ. раствор;

2. промывка (5-10 мин.);

3. высушиваем, микроскопируем.

Непрямой метод:

1. на фиксируемый мазок наносят каплю немеченой сыворотки 1:10;

2. промывка для удаления сыворотки;

3. на мазок помещают

4. сушка, микроскопирование.

Достоинства:

1. специфичность и чувствительность

2. дисков упрощенное хранение, транспортировка и использование (в стационарных и полевых условиях).

РНИФ (Уэллер, КУНС, 1954г.).

Метод используется в двух направлениях:

а) определение неизвестных антигенов;

б) обнаружение антител.