5. Иммуноэлектрофорез.

Представляет собой сочетание электрофореза в агаровом геле с иммунодиффузией. В настоящее время существует много вариантов метода. Наиболее часто применяется метод по Гарабарю. Он состоит из следующих этапов:

1. Электрофоретическое разделение (от катода к аноду) белков (антигенов) в агаровом геле.

2. Добавление преципитирующей сыворотки в канавку, которая идет в направлении миграции белков.

3. В месте взаимодействия антигенов и антител возникают дугообразные линии преципитации. Число, положение, форма линий дает представление о составе исходной смеси антигенов.

Иммуноэлектрофорез – широко распространенный метод качественного анализа антигенов.

Применяется: для качественного анализа белка сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи, кала, экстрактов из органов и т. д.

Разновидности иммуноэлектрофореза:

• диск – иммуноэлектрофорез;

• встречный иммуноэлектрофорез «ВИЭФ» (электросинтез)

• ракетный иммуноэлектрофорез;

• иммуноэлектрофокусирование;

• радиоиммуноэлектрофорез;

• иммуноблотинг и т. д.

В настоящее время чаще используют ВИЭФ – метод основан на контакте антигена с антителом, обусловленном не их свободной диффузией, а эффектом постоянного электрического поля, усиливающего способность к взаимодействию низкореактогенных компонентов.

Особенности:

• наличие электрофоретической подвижности антигенов;

• высокая чувствительность (в 10 раз выше метода двойной иммунодиффузии);

• возможность идентификации антигенов, которые не выявляются иммунодиффузией;

• высокая скорость реакции: 1 – 3 часа.

3. Реакция флоккуляции: определение, компоненты, механизм, методика постановки, применение.

Метод предложил Рамон в 1924 году.

Определение: специфическое взаимодействие токсина (антигена) с антитоксином (антителом), выражающееся в образовании осадка (лат. floccus – хлопья шерсти).

Компоненты:

1. Антиген – токсин, анатоксин.

2. Антитело – антитоксическая сыворотка.

Механизм: аналогичен преципитации.

Начальная (инициальная) флоккуляция наступает при наличии эквивалентного соотношения токсина и антитоксической сыворотки. Проявляется возникновением помутнения.

Методика постановки: реакция ставится в пробирках в 2 этапа:

I этап:

1. Определение пороговой величины флоккуляции в 1 мл токсина – Zf токсина (Zimes flocculations). Zf токсина – минимальное его количество, которое дает инициальную флоккуляцию с 1 мл сыворотки.

II этап:

1. Титрование антитоксической сыворотки;

2. Добавление одинакового объема токсина с известной Zf;

3. Инкубация при 45º С (водяная баня) – 30 мин.

4. Учет результатов по выпадению хлопьев флоккулята, при начальной флоккуляции. Определение АЕ сыворотки по Zf токсина.

Н апример, иннициальная флоккуляция отмечена в пробирке, где находилось 0,2 мл сыворотки и 2 мл известного токсина активностью 100 Zf (50 Zf х 2). Значит, 0,2 мл сыворотки содержат 100 АЕ, тогда в 1 мл этой сыворотки концентрация антител соответствует 500 АЕ (0,2 мл 100 АЕ, 1 мл Х, Х = 100 : 0,2)

Практическое применение:

1. Титрование антитоксической сыворотки, определение АЕ;

2. Титрование анатоксина и токсина, определение Zf.