2.2. Метод постановки реакції гемаглютинації

Сутність методу полягає у здатності вірусу хвороби Ньюкасла аглютинувати еритроцити курей.

Для проведення дослідження застосовують додаткову апаратуру: мікротитратор Такачі; дошки з плексигласу.

Проведення дослідження. Готують дворазові розведення вірусовмісного матеріалу від 1 : 2 до 1 : 1024. Для цього в ряд лунок планшетки з плексигласу (або пробірок) наливають фізіологічний розчин в об’ємі 0,2 см³. Потім в першу лунку вносять 0,2 см³, вірусу, трикратно піпетують і переносять 0,2 см³ суміші в другу лунку і так далі, до необхідного розведення. З останньої лунки 0,2 см³ суміші видаляють у дезінфікуючий розчин (1 %‑вий розчин гідроксиду натрію).

У кожну лунку додають по 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії курячих еритроцитів. Планшети з лунками струшують залишають за кімнатної температури на 30 хв.

Контролем реакції служать дві лунки (пробірки) з еритроцитами і фізіологічним розчином у рівних об’ємах, по 0,2 см³ кожного. РГА також можна ставити мікротитратором Такачі в об’ємі 0,025 см³ в планшетах з лунками.

Обробка результатів. Утворення на дні і стінках лунок (пробірок) осаду еритроцитів у вигляді перекинутої «парасольки» свідчить про позитивну РГА.

За негативної реакції в досліді і контролі еритроцити утворюють на дні лунок (пробірок) диск з рівними краями.

Титром вірусу вважається граничне розведення, за якого спостерігається повна аглютинація еритроцитів, що відповідає 1 гемаглютинувальної одиниці (1 ГАО).

2.3. Метод ідентифікації вірусу

Сутність методу полягає у здатності специфічних антитіл нейтралізувати гемаглютинуючу здатність вірусу в реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) з еталонними специфічними сироватками до вірусу хвороби Ньюкасла і типування антитіл у сироватці крові хворої, перехворілої або підозрюваної у захворюванні птиці з еталонними діагностичними антигенами вірусу хвороби Ньюкасла. Для диференціації в реакцію вводять сироватку проти вірусу грипу птиці.

Для проведення дослідження застосовують додаткову апаратуру та реактиви: апарат Кіппа; баню водяну; кислоту соляну 30 %‑вий розчин; крейду; набір діагностичний спеціальний, який містить по одній ампулі (флакону) сухого еталонного антигену вірусу хвороби Ньюкасла та грипу птиці (по 1 см³ антигену в кожній розфасовці) і по одній ампулі (флакону) специфічної імунної сироватки до вірусу хвороби Ньюкасла і вірусу грипу птиці ( по 1 см³ сироватки в кожній розфасовці); сироватки імунні, які готують наступним чином: вміст ампули (флакона) зі специфічною сироваткою розводять 1 см³ фізіологічного розчину.

Антиген готують наступним чином: ампули (флакони) з антигенами розводять фізіологічним розчином (рН 7,2‑7,4) до початкового об'єму висушеного вірусу, тобто додають 1 см³ фізіологічного розчину.

Підготовка до дослідження. Для отримання робочої дози вірусу (4 ГАО) зразок ембріональної рідини або антигену розводять фізіологічним розчином у стільки разів, скільки отримують від ділення на 4 цифри, що вказує гемаглютинуючий титр вірусу.

Наприклад, якщо титр гемаглютинації 1 : 256, то робоче розведення буде 256 : 4 = 64. Для його приготування необхідно взяти 63 см³ фізіологічного розчину і 1 см³ вихідного вірусу. Розведений 1 : 64 вірус буде містити 4 ГАО.

Перед постановкою основного досліду перевіряють правильність вибору 4 ГАО. Для цього беруть п'ять лунок; в першу і другу наливають по 0,2 см³ вірусовмісного 4 ГАО, після чого в другу, третю, четверту і п'яту лунки наливають по 0,2 см³ фізіологічного розчину. Після піпетування з другої лунки переносять 0,2 см³ суміші в третю і так далі. З п'ятої лунки видаляють 0,2 см³ в дезінфікуючий розчин. Таким чином в другій лунці залишається 2 ГАО, у третій 1 ГАО, у четвертій - 0,5 ГАО, а в п'ятій ‑ 0,25 ГАО. Після цього в кожну лунку додають по 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів, дошки струшують і залишають на 30 хв за кімнатної температури.

При правильному виборі робочої дози (4 ГАО) в першій, другій і третій лунках повинна бути повна аглютинація, а в четвертій і п'ятій лунках аглютинації не повинно бути.

Якщо в четвертій лунці виявляється часткова або повна аглютинація, то це означає, що обрана доза вірусу містить не 4 ГАО, а більше. У цьому випадку доза повинна бути зменшена. Особливо важливо, щоб в третій лунці, де повинна бути 1 ГАО вірусу, була повна аглютинація. Якщо в ній аглютинація неповна, то обрана робоча доза містить менше 4 ГАО і повинна бути збільшена.

Для приведення робочої дози до 4 ГАО додають відповідно фізіологічний розчин або вірус і повторно перевіряють величину робочої дози вірусу.

Проведення дослідження. Для постановки основного досліду в ряд лунок, починаючи з другої, наливають по 0,2 см³ фізіологічного розчину. Потім в першу і другу лунки додають по 0,2 см³ приготовленої специфічної сироватки. У другій лунці піпетують і переносять 0,2 см3 суміші в третю лунку і так далі до необхідного розведення. Після цього в усі лунки вносять по 0,2 см³ робочого розведення вірусу (4 ГАО). Дошки струшують і після 30 хв контакту сироватки з вірусом в кожну лунку додають по 0,4 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів.

Для точності обліку РЗГА ставлять контроль:

- сироватки - для виключення присутності гемаглютинінів до курячих еритроцитів (0,2 см³ сироватки, 0,2 см³ фізіологічного розчину і 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів);

- стандартних діагностикумів (0,2 см³ 2 ГАО антигену, 0,2 см³ гомологічної йому сироватки і 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів);

- еритроцитів - на спонтанну аглютинацію (0,2 см³ фізіологічного розчину і 0,2 см³ 1 %‑вої суспензії еритроцитів).

Облік результатів проводять візуально через 20‑30 хв після осідання еритроцитів у контролі.

Обробка результатів. РЗГА вважають позитивною, якщо специфічна сироватка до вірусу хвороби Ньюкасла повністю затримує гемаглютинуючу активність вірусу (дослідного штаму) не менше ¼ до ⅛ її гомологічного титру.