2. Транспорт білків. Екзоцитозний шлях

Транспорт білків здійснюється кількома шляхами, основний з них екзоцитозний. Екзоцитозним в еукаріотичних клітинах називається шлях, за допомогою якого здійснюється транспорт білків, які секретуються клітинами або включаються в зовнішню мембрану. Білки синтезуються на рисосомах шорсткого ЕПР і виводяться з клітини за допомогою того ж механізму, який використовується для включення мембранних білків в ЕПР.

Якщо водорозчинний білок не має вторинних сигналів сортування, то він транспортується до клітинної поверхні і секретується за допомогою «конститутивного» шляху. Білки, що транспортуються цим шляхом, переміщуються з ЕПР послідовно через різні компартменти комплексу Гольджі і врешті-решт потрапляють на поверхню клітини. Вони можуть ставати компонентами цитоплазматичної мембрани або, при наявності вторинних сигналів сортування, залишатися в ЕПР (цитохром Р₄₅₀) або в комплексі Гольджі (різні глікозилтрансферази).

У комплексі Гольджі в ході подальшого сортування відокремлюються білки, які секретуються конститутивним шляхом (укорочений шлях), від тих, які направляються в лізосоми або концентруються в секреторних гранулах, за допомогою яких вони потім секретуються при відповідній стимуляції клітини (тобто регульований секреторний шлях). Крім того виявлено, що в зовнішній мембрані ядерної оболонки також можуть синтезуватися мембранні глікопротеїни, які потім транспортуються за допомогою екзоцитозу. Білки при транспортуванні по екзоцитозному шляху піддаються посттрансляційним модифікаціям, зокрема глікозилюванню.

Дослідження виявили кілька особливостей системи екзоцитозного транспорту.

1. Транспорт між різними компартментами органели здійснюється за допомогою везикул, які відокремлюються від «донорної» мембрани і потім зливаються з «акцепторною». Показано, що везикули, які беруть участь в транспорті між компартментами комплексу Гольджі, є «облямованими», але відповідний білок відрізняється від клатрину, що обмережує ендоцитозні везикули. Є вагомі дані на користь того, що клатрин не є істотним компонентом екзоцитозного шляху.

2. Для внутрішньоклітинного транспорту необхідний АТФ, а також білкові компоненти цитозолю. Показано, що для транспорту між цистернами Гольджі, що здійснюється за участю везикул, необхіден ацил-КоА. Яку саме функцію виконують зазначені сполуки у відбруньковуванні і злитті везикул, невідомо.

3. Роль олігосахариду як сигналу сортування новосинтезованих глікопротеїнів, мабуть, непостійна.

3. Сигнальні послідовності білків. Сигнальні пептидази

У більшості білків, вбудованих в мембрану ЕПР або перетинаючих її, на N-кінці є «короткоживучий» сигнальний пептид (від 15 до 30 амінокислотних залишків). Ця сигнальна послідовність безпосередньо взаємодіє принаймні з двома рецепторами, один з яких розчинний (сигнал-розпізнаюча частина), а інший перебуває в мембрані. Можна було б очікувати, що амінокислотна послідовність цього сигнального пептиду буде дуже консервативною і приблизно однаковою у всіх переношуваних білків, але очікування ці не виправдалися. Ці сигнальні ділянки не відрізняються сталістю ні щодо довжини, ні щодо амінокислотної послідовності, а численні досліди по мутагенезу показали, що вони можуть зазнавати значних структурних змін. Дані про те, що сигнальні пептиди містять всю інформацію, необхідну для транспорту білків через мембрани ЕПР або всередину їх, були отримані в дослідах з химерними поліпептидами. Приєднання N-кінцевої сигнальної послідовності до звичайних цитоплазматичних білків, наприклад до глобіну, призводило до того, що вони транспортувалися в порожнину ЕПР.

З точки зору «порівняльної анатомії» N-кінцевих сигнальних послідовностей можна виділити три різних у структурному відношенні ділянки: 1) позитивно заряджену N-кінцеву ділянку (n-ділянка), 2) центральне гідрофобне ядро з 7-15 залишків (h-ділянка); З) С-кінцеву ділянку (с-ділянка), яка є полярною і містить сайт, впізнаваний сигнальною пептидазою, яка знаходиться на стороні ЕПР, зверненої в порожнину.

Відомо, що відносно невеликі відмінності між сигнальними послідовностями породжують величезні відмінності в поведінці білка. Наприклад, якщо сигнальна послідовність не розпізнається сигнальною пептидазою, то білок частіше залишається зв'язаним з мембраною, ніж секретується, хоча є й винятки з цього правила. Водночас, природа стоп-сигналу переносу точно не відома. Необхідно з'ясувати два питання: 1) чи беруть участь в зупинці процесу специфічні білки апарату перенесення, 2) чи визначається зупинка перенесення гідрофобіністю стоп-сигналу або якимись більш тонкими факторами? Було показано, що ділянки стоп-сигналів послідовності, відповідальні за блокування переносу через ЕПР, можуть ніяк не впливати на транспорт через мембрану хлоропласта. Це означає, що згадані два процеси можуть істотно різнитися.

Сигнальні пептидази

Для видалення тимчасових N-кінцевих сигнальних пептидів необхідні специфічні білки. Найбільш повно охарактеризовані сигнальні протеази з Е. coli. Більшість експортованих білків Е. coli містять сигнальний пептид, який відщеплюється на периплазматичній поверхні внутрішньої мембрани за допомогою лідер-пептидази. Для переносу білків через внутрішню мембрану ця пептидаза не потрібна, але вона необхідна для вивільнення експортованого білка з цитоплазматичної мембрани. In vitro очищений фермент міг функціонувати, будучи включеним у ліпосоми. Специфічність розщеплення вельми висока, але не визначається виключно амінокислотною послідовністю поблизу сайту розщеплення.

Сигнальна пептидаза, яка функціонує в ЕПР, має ту ж специфічність, що і відповідний фермент Е. coli, що недивно, якщо врахувати подібність сигнальних послідовностей. Була очищена сигнальна пептидаза з мікросом еукаріотів.

У мітохондріях і хлоропластах повинні бути присутні кілька сигнальних пептидаз, оскільки процесинг відбувається більше, ніж в одному компартменті. Розчинну пептидазу з мітохондріального матриксу вдалося частково очистити, але охарактеризована вона не повністю.