РЕСПУБЛИКА  КАЗАХСТАН Казахстанско-Российский медицинский университет. Кафедра: Молекулярной биологии и медицинской генетики   Реферат по молекулярной биологии   На тему: Репарация ДНК

                                                    

Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Структурные и динамические аспекты функционирования днк-n-гликозилаз в процессе эксцизионной репарации оснований днк"

Ежедневно в молекулах ДНК каждой клетки человеческого тела около 100000 звеньев повреждаются за счет разнообразных эндогенных процессов и экзогенных генотоксичных воздействий. Повреждение ДНК может приводить к появлению мутаций, провоцировать гибель клетки или служить толчком к ее злокачественному перерождению. Для предотвращения таких последствий в клетке существует несколько взаимодополняющих ферментативных систем, которые поддерживают процессы, носящие общее название «репарация ДНК». Главная цель всех этих систем — восстановление последовательности ДНК, существовавшей до ее повреждения, или, если это невозможно, сведение изменений к минимуму.

Системы репарации отличаются друг от друга используемыми субстратами, ферментами и механизмами устранения поврежденных звеньев. На текущий момент выделяют 6 главных систем репарации. В ходе нескольких не связанных друг с другом процессов, объединяемых под общим названием реактивации, поврежденные основания ДНК непосредственно превращаются в нормальные без расщепления ДНК и последующего ее синтеза; например, образующиеся под действием ультрафиолетового излучения циклобутановые пиримидиновые димеры превращаются в два исходных пиримидиновых основания прокариотическим ферментом фотолиазой при облучении светом видимого спектра, а Ш-алкилпурины превращаются в канонические пурины при окислении алкильной группы диоксигеназой А1кВ. Все остальные системы репарации действуют с деградацией и повторным синтезом поврежденной части ДНК. В случае сильного повреждения ДНК — образования двуцепочечных разрывов, обширных однонитевых брешей, сшивок между цепочками — функционирует система рекомбинационной репарации, при которой поврежденная ДНК исправляется за счет рекомбинации с полноценной копией генетического материала, если та присутствует в клетке. Двуцепочечные разрывы также могут лигироваться в процессе воссоединения негомологичных концов, что, однако, ведет к потере части генетического материала. Неканонические пары оснований и короткие гетеродуплексы в ДНК узнаются системой репарации гетеродуплексов, которая удаляет фрагмент ДНК длиной до нескольких сотен дезоксирибонуклеотидов, включающий неканонический элемент, и застраивает образовавшуюся брешь. Для эксцизионной репарации нуклеотидов, субстратами которой являются объемные аддукты в ДНК, также характерно вырезание участка ДНК с последующим синтезом, но сам участок ограничен несколькими десятками дезоксирибонуклеотидов.

Считается, что нарушение механизмов репарации ДНК в целом приводит к различным патологическим процессам, в число которых входят канцерогенез, дефекты развития и старение. На сегодняшний день известен ряд наследственных заболеваний, причиной которых служат нарушение репарации ДНК. Дефекты системы эксцизионной репарации нуклеотидов приводят к возникновению пигментной ксеродермы, синдрома Кокейна и трихотиодистрофии. Наследственный неполипозный рак толстой кишки может вызываться мутациями некоторых генов системы репарации гетеродуплексов. Многие синдромы предрасположенности к онкологическим заболеваниям — ретинобластома, семейный аденоматозный полипоз и т. п. — связаны с нарушениями систем ответа на повреждение ДНК.

Наиболее распространенные типы повреждения ДНК — одноцепочечные разрывы, апурин-апиримидиновые сайты и поврежденные основания — репарируются с помощью эксцизионной репарации оснований. При повреждении оснований ДНК этот процесс инициируется ферментами ДНК-гликозилазами, которые гидролизуют iV-гликозидную связь между поврежденным основанием и дезоксирибозным фрагментом. У всех живых организмов имеется несколько ДНК-гликозилаз с разной субстратной специфичностью; так, из клеток человека и Escherichia coli на момент начала данной работы было известно по 8 ДНК-гликозилаз. Некоторые из них обладают весьма узкой субстратной специфичностью, удаляя из ДНК поврежденные основания только одного вида (например, урацил), другие же могут выщеплять разнообразные поврежденные основания, относящиеся в целом к одному классу (например, окисленные пиримидины). Исходя из последовательностей и пространственных структур, ДНК-гликозилазы можно разделить на несколько семейств, совершенно не родственных друг другу. Тем не менее, некоторые ДНК-гликозилазы, относящиеся к разным семействам, могут использовать в качестве субстрата ДНК, содержащую одно и то же поврежденное основание. Таким образом, они являют собой пример конвергентной эволюции белков, когда разные по происхождению ферменты выполняют одну и ту же функцию в клетке.

До сих пор не решен вопрос, каким образом ДНК-гликозилазы осуществляют дискриминацию субстратных и несубстратных азотистых оснований. Многие поврежденные азотистые основания отличаются от канонических оснований ДНК всего одним или несколькими атомами, поэтому фермент должен с исключительной точностью выбирать выщепляемое основание на фоне огромного избытка неповрежденных звеньев ДНК. С другой стороны, многие поврежденные азотистые основания могут быть очень похожими на основания, выщепляемые какой-либо ДНК-гликозилазой, но не использоваться ей в качестве субстрата. Ясно, что связывание субстратного основания в активном центре фермента должно предваряться его селекцией среди других оснований, которые в принципе могут, но не должны служить субстратами. Изучение механизмов такой селекции субстратов на сегодняшний день чрезвычайно актуально не только для углубления знаний собственно о репарации ДНК, но и для понимания механизма действия ферментов вообще и создания белковых катализаторов с заданными свойствами.

Для исследования ДНК-гликозилаз на сегодняшний день применяются самые передовые подходы физико-химической биологии. Строение ряда ДНК-гликозилаз установлено методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса. Создан большой набор модифицированных звеньев ДНК, позволяющий анализировать закономерности узнавания поврежденных оснований. Современные молекулярно-биологические методы позволяют получать формы белков с измененной структурой и анализировать их свойства. Однако, несмотря на это, остается большой редкостью комбинированный подход к изучению ДНК-гликозилаз, который сочетал бы различные взаимодополняющие структурные и биохимические методы в систематическом исследовании механизмов узнавания этими ферментами поврежденных оснований.

Основной целью данной работы являлось установление закономерностей и механизмов узнавания и расщепления ДНК-гликозилазами поврежденной ДНК в процессе эксцизионной репарации оснований.

Для достижения поставленной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

• Определить структуры ДНК-гликозилаз, ранее не охарактеризованные в литературе, в комплексе с ДНК и в свободном состоянии;

• Дополнить структурные данные компьютерными моделями динамического поведения фермент-субстратных комплексов и проанализировать консервативность физико-химических свойств аминокислотных остатков в ключевых участках пространственной структуры ДНК-гликозилаз;

• Исследовать активность ДНК-гликозилаз по отношению к разным видам поврежденной ДНК, термодинамические и кинетические параметры взаимодействия этих ферментов с ДНК;

• Проследить изменение конформации ДНК-гликозилаз в ходе катализа и установить природу конформационных переходов;

• Исследовать влияние замен различных аминокислотных остатков на активность и субстратную специфичность ДНК-гликозилаз;

• Изучить динамику перераспределения ДНК-гликозилаз в эукариотической клетке в ответ на генотоксический стресс.

2. Литературный обзор

Заключение диссертации по теме "Биологические науки -- Генетика -- Молекулярная генетика -- Молекулярные основы изменчивости -- Молекулярные механизмы мутаций -- Репарации повреждений ДНК", Жарков, Дмитрий Олегович

6. Выводы

1. Проведены структурно-функциональные исследования эндонуклеазы VIII (Nei) из Е. coli:

• Методом рентгеноструктурного анализа (РСА) определены пространственные структуры фермента дикого типа и его мутантных форм с заменами критически важных аминокислотных остатков Glu2 и Arg252 в свободном состоянии и в ковалентном комплексе с ДНК, имитирующем интермедиат реакции, катализируемой этой эндонуклеазой.

• Показано, что при связывании поврежденной ДНК некоторые консервативные мотивы фермента изменяют конформацию и подвижность, а отдельные домены белка изменяют пространственную ориентацию, что приводит к сборке активного центра фермента.

• Установлено, что аминокислотные остатки Lys52, Asnl68 и Arg252 фиксируют остов ДНК в активном центре фермента, остатки Gln69, Leu70 и Туг71 обеспечивают выворачивание поврежденного звена в активный центр, остатки Prol и Glu2 участвуют в нуклеофильной атаке и протонированиидезоксирибозного цикла в ходе катализа, остатки Arg 173 и Gln261 обеспечивают корректное позиционирование цинкового пальца, а остаток Arg212 образует связи с поврежденным основанием.

• Показано, что активный центр Nei обладает достаточной пластичностью для частичной компенсации структурных изменений, образующихся при замене критически важных аминокислотных остатков.

• Методом «остановленной струи» с регистрацией флуоресценции остатков триптофана установлено, что каталитический акт с участием Nei включает как минимум пять стадий, сопровождающихся конформационными изменениями фермента. Три из них обратимы и отражают связывание ДНК и взаимную подгонку структур фермента и ДНК до каталитически компетентной конформации, одна необратимая стадия соответствует образованию и разрыву ковалентных связей в ходе реакции, и последняя, обратимая стадия связана с высвобождением продукта реакции.

2. Проведены структурно-функциональные исследования форМамидопиримидин-ДНК-гликозилазы (Fpg) из Е. coli:

• Методом РСА определена пространственная структура фермента в ковалентном комплексе с ДНК, имитирующем интермедиат реакции.

• Методом молекулярной динамики проведено компьютерное моделирование взаимодействий неповрежденных и поврежденных азотистых оснований (гуанин, 8-оксогуанин, 8-оксоаденин, 4,6-диаминопиримидин-5-илформамид, 2,4-диамино-6-оксо-1,6-дигидропиримидин-5-илформамид) в активном центре фермента, определены взаимодействия, важные для субстратной специфичности фермента.

• Установлено, что аминокислотные остатки Lys56, Asnl68 и Arg258 фиксируют остов ДНК в активном центре фермента, остатки Met73, Argl08 и PhellO обеспечивают выворачивание поврежденного звена в активный центр, остатки Prol и Glu2 участвуют в нуклеофильной атаке и протонировании дезоксирибозного цикла в ходе катализа, остатки His89, Arg 108 и Arg 109 обеспечивают изгиб ДНК, а остаток Lys217 образует связи с поврежденным основанием.

• Показано, что связывание ферментом Fpg поврежденной ДНК при низких температурах определяется энтропийным компонентом и сопровождается значительной дегидратацией поверхности взаимодействия, а при приближении к физиологическим температурам возрастает вклад энтальпийного компонента.

• Методом «остановленной струи» с регистрацией флуоресценции остатков триптофана и 2-аминопуриновой метки в ДНК установлено, что каталитический акт с участием Fpg включает как минимум семь стадий, сопровождающихся конформационными изменениями фермента. Пять из них обратимы и отражают связывание ДНК и взаимную подгонку структур фермента и ДНК до каталитически компетентной конформации, одна необратимая стадия соответствует образованию и разрыву ковалентных связей в ходе реакции, и последняя, обратимая стадия связана с высвобождением продукта реакции. Сравнение структуры фермента и данных предстационарной кинетики с различными субстратами и мутантными формами фермента позволило отнести эти стадии к неспецифичному связыванию ДНК, внедрению в ДНК интеркалирующего остатка PhellO, выворачиванию поврежденного звена ДНК в активный центр фермента, внедрению в ДНК интеркалирующих остатков Met73 и Arg 108 и изомеризации активного центра фермента.

3. Открыты ДНК-гликозилазы высших эукариот, гомологичные белкам Fpg и Nei -NEIL1, NEIL2, NEIL3. Определен механизм действия фермента NEIL1, показана его роль в предохранении клеток млекопитающих от повреждения ДНК, вызываемого ионизирующей радиацией. Проведен сравнительный анализ последовательностей и пространственных структур Fpg, Nei и их известных гомологов. По результатам анализа выделена группа Fpg/Nei как отдельное структурное суперсемейство ДНК-гликозилаз, отличное от известных суперсемейств эндонуклеазы III (Nth) и урацил-ДНК-гликозилазы, определены консервативные мотивы, ответственные за активность и субстратную специфичность этих ферментов.

4. Проведено исследование субстратной специфичности Fpg и Nei из Е. coli, NEIL1 и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы млекопитающих (OGG1).

• Показано, что в узнавании и превращении различных субстратов одним и тем же ферментом могут участвовать разные структурные элементы.

• Выделен мотив «головки считывания», важный для непрямого узнавания поврежденных оснований ДНК ферментами Fpg и Nei по вносимой ими в структуру ДНК нестабильности.

• Установлены и объяснены в рамках определенных структур ДНК-ферментных комплексов закономерности взаимодействия ферментов Fpg, OGG1 и NEIL1 с субстратами, содержащими кластерные повреждения.

5. Методом PC А установлена пространственная структура принадлежащего к суперсемейству Nth фермента эндонуклеазы V бактериофага Т4 в ковалентном комплексе с ДНК, имитирующем интермедиат реакции. На основании сравнения всех установленных структур ковалентных комплексов ДНК-гликозилаз и ДНК предложен механизм реакции Р-элиминации, катализируемой бифункциональными ДНК-гликозилазами суперсемейств Nth и Fpg/Nei.

6. Обнаружено ингибирование фермента OGG1 ионами Cd , которое может объяснять синергизм токсичности кадмия и окислительного стресса в клетках млекопитающих. Описано два пути ингибирования, один из которых связан с необратимой инактивацией фермента, а другой — с обратимым связываниемиона Cd2+ с ферментом или фермент-субстратным комплексом.

7. -Установлено, что цитоплазматическая фракция фермента OGG1 при мягком окислительном стрессе, вызванном голоданием, перераспределяется и преимущественно накапливается в клеточном ядре. Показано, что цитоплазматическая фракция OGG1, ДНК-гликозилазы NEIL2 и ДНК-полимеразы Р ассоциирована с микротрубочками.

5. Заключение

Настоящая работа представляет собой первое систематическое исследование, в результате которого был разработан комплексный подход к анализу активности и субстратной специфичности ключевых ферментов репарации — ДНК-гликозилаз, в целом применимый к любым ферментам. Подход объединяет исследование ферментов с помощью метода рентгеноструктурного анализа (РСА), компьютерное моделирование и сравнение физико-химических свойств аминокислотных остатков в группах белковых последовательностей для формирования представлений о возможных функциях отдельных аминокислотных остатков в данных белках, и сайт-направленный мутагенез, изучение термодинамики и кинетики взаимодействия ферментов с субстратами разной степени специфичности в стационарном и предстационарном режиме для экспериментальной проверки выдвинутых предположений. Использование такого подхода позволило изучить функции нескольких ДНК-гликозилаз бактериальной и эукариотической природы на уровнях от субмолекулярного до клеточного.

Методы структурного анализа высокого разрешения (РСА, ЯМР) в наши дни активно применяются не просто для установления структур белков, но и для исследования механизмов их функционирования, для чего необходимо определение структур белка в разных функциональных состояниях (например, комплексов фермента с разными типами субстратов, продуктов и ингибиторов) и определение структур близко родственных белков. В настоящей работе была впервые определена структура эндонуклеазы VIII из Е. coli (Nei) как в свободном виде, так и в комплексе с ДНК, структура формамидопиримидин-ДНК-гликозилазы из Е. coli (Fpg) в комплексе с ДНК и структура эндонуклеазы V бактериофага Т4 (DenV) в ковалентном комплексе с ДНК. Таким образом была закончена структурная характеризация представителей всех главных семейств ДНК-гликозилаз. Наилучшим образом со структурной точки зрения был охарактеризован белок Nei, что позволило выявить конформационные изменения, происходящие при связывании им ДНК. Было также выявлено важное свойство — пластичность его активного центра, частично компенсирующая замены критических аминокислотных остатков. В целом структуры Fpg и Nei обнаруживают новый тип укладки ДНК-связывающих белков, в котором решающая роль в связывании ДНК принадлежит немногочисленным гибким петлям, фиксированным на более жестких элементах структуры (ß-сэндвич, мотив «спираль—два поворота—спираль», цинковый палец), которые разнесены по двум доменам белка и могут собираться вместе при связывании субстрата. Это делает структурную организацию Fpg и Nei потенциально полезной для инженерии ДНК-зависимьгх ферментов с новыми субстратными специфичностями.

Комбинация структурных, вычислительных и биохимических методов позволила в настоящей работе предложить механизм узнавания поврежденных оснований ферментами Fpg и Nei, который, вполне вероятно, может функционировать также в других ДНК-гликозилазах и в ферментах других классов. Согласно этому механизму, узнавание поврежденного звена начинается с того, что фермент вносит искажение в конформацию ДНК; в структуре Fpg обнаружен «седловой мотив», который идеально подходит для этой роли. По-видимому, неповрежденная ДНК достаточно устойчива к такой деформации, а поврежденная менее стабильна и может изламываться в точке повреждения. Затем следуют несколько последовательных шагов, сопровождающихся конформационными изменениями фермент-субстратного комплекса, в ходе которых аминокислотные остатки фермента внедряются в ДНК, а поврежденное звено выворачивается в активный центр фермента. На каждой из этих стадий в принципе возможна дискриминация ферментом поврежденных и неповрежденных оснований с тем, чтобы максимально облегчить попадание в активный центр поврежденных оснований и максимально затруднить это для неповрежденных. Наконец, окончательное узнавание ферментом поврежденного основания в ДНК происходит при образовании в активном центре наборов контактов, причем, по-видимому, ДНК-гликозилазы с достаточно широкой субстратной специфичностью могут образовывать несколько разных наборов контактов, обеспечивающих эффективное вьпцепление разных оснований. Подобные многоступенчатые механизмы могут в принципе использоваться для предотвращения процессинга неправильных субстратов в случае, когда цена ошибки достаточно высока (например, сходные механизм селекции субстрата действуют у сериновых протеаз и ДНК-полимераз).

В ходе работы открыта новая группа эукариотических ферментов, гомологичных Fpg и Nei. Активности этих ферментов (NEIL1-NEIL3) могут расширять спектр субстратов, репарируемых в клетках млекопитающих по механизму эксцизионной репарации оснований (ЭРО). Например, фермент NEIL1 удаляет из ДНК некоторые стереоизомеры тимингликоля, которые не выщепляются другими ферментами репарации окисленных пиримидинов. Кроме того, он может принимать участие в репарации поврежденных оснований, соседствующих с разрывами в составе кластерных повреждений ДНК. Эти активности важны для снижения повреждающего действия ионизирующего излучения; вполне вероятно, что и другие ферменты NEIL обладают уникальными свойствами, обеспечивающими им место в процессе ЭРО.

Проведены исследования одной из важнейших ДНК-гликозилаз млекопитающих, 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы (СЮ01). Помимо изучения механизмов узнавания ею субстратов, в том числе кластерных повреждений, в настоящей работе показано, что ее инактивация может вносить вклад в генотоксичноедействие ионов С<12+. Еще более интересным оказалось то, что цитоплазматическая фракция 0001 по крайней мере частично связана с микротрубочками и может быстро перемещаться в ядро при генотоксическом стрессе. Помимо 0001, была показана ассоциация с микротрубочками ДНК-гликозилазы ЫЕ1Ы и ключевого фермента ЭРО — ДНК-полимеразы р. Возможно, что именно с участием микротрубочек может при необходимости происходить динамическое перераспределение и быстрая мобилизация цитоплазматических резервов ферментов репарации.

Проведенная экспериментальная работа позволила достаточно подробно ответить на вопросы, стимулировавшие постановку цели и определившие список задач исследования. В работе получены данные, не имеющие аналогий в мировой литературе. Список публикаций, в которых представлены результаты работы, приведен в Приложении 3. Однако достигнутые цели позволили сформулировать несколько новых перспективных направлений исследований. В частности, как показали результаты опытов с ферментом Fpg, очень перспективно исследование структурной динамики ДНК-гликозилаз при направленном введении флуоресцентных меток в разные части фермента или субстрата, в особенности в сочетании с компьютерным моделированием разных этапов процесса узнавания субстрата. Весьма интересным является вопрос о влиянии разнообразных факторов — внутриклеточных условий, других ферментов ЭРО, встречающихся в природе полиморфизмов — на субстратную специфичность ДНК-гликозилаз. Очень слабо исследован на текущий момент процесс поиска поврежденных звеньев ДНК-гликозилазами, и их взаимодействия с неповрежденной ДНК нуждаются в углубленном изучении. Наконец, практически не изучены взаимодействия ДНК-гликозилаз с компонентами клетки, не относящимися к системе ЭРО. О возможности неожиданных находок в этой области, помимо наших результатов, говорит хотя бы тот факт, что при протеомном изучении взаимодействий ДНК-гликозилаз было обнаружено связывание 0001 сбелками процессинга мРНК — комплексами кэппинга и полиаденилирования. Можно с уверенностью утверждать, что изучение различных аспектов функционирования ДНК-гликозилаз будет в ближайшие годы чрезвычайно актуально.

1. Эксцизионная репарация с помощью белков комплекса uvrABC.

Более радикальным и эффективным путем устранения нарушений нуклеотидов является эксцизионной репарации (excision repair), когда повреждена одноцепная участок вырезается из ДНК, а другая цепь используется далее как матрица для нового синтеза. Существует два варианта такой репарации. При эксцизионной репарации азотистых оснований (Base Excision Repair BER), что происходит у всех организмов, модифицированная азотистое основание удаляется ферментом гликозилазою. Существует определенное количество специфических гликозилаз, распознающих различные модифицированные основания. Гликозилаза разрушает гликозидной связи между основой и С1'-атомом дезоксирибозы (рис. 9.24). В ДНК остается так называемый АП-сайт (апуриновий / апиримидиновий), который узнается эндонуклеазой, что гидролизует фосфодиэфирных связь между 5'-фосфатом освобожденной от основания дезоксирибозы и предыдущим нуклеотидом. Наконец фосфодиэстеразы отщепляет эту фосфодезоксирибозу, и в ДНК остается пробел длиной в один нуклеотид. Этот пробел восполняется ДНК-полимеразой ? (в эукариот), которая присоединяет нуклеотид к 3'-ОН группы предыдущего нуклеотида цепи. Фосфодиэфирных связь присоединенного нуклеотида с последующим нуклеотидом цепи восстанавливается лигазы. У прокариот заполнение пробела осуществляется ДНК-полимеразой И. При этом, за счет своей 5-екзонуклеазнои активности, полимераза может разрушать определенный участок с 5'-конца пробелы, одновременно продолжая 3'-конец. Эксцизионной репарации нуклеотидов (Nucleotide Excision Repair NER)? процесс, связанный с вырезанием участки ДНК, которая содержит повреждения (модифицированную основу, тиминовых димер т.д.). В клетках E. coli за этот путь отвечает система uvrABC (uvr ultra violet repair). Комплекс белка uvrB и двух белков uvrA узнает повреждения и связывается с ДНК в этом месте (рис. 9.25). На следующем шаге происходит АТР-зависимая изменение конформации uvrB, изгиб ДНК и диссоциация uvrA. К комплексу рекрутируется белок uvrС. Оба белки в составе комплекса приобретают ендонуклеазнои активности: uvrС делает одноцепочечный разрез в поврежденном цепи за несколько нуклеотидов в направлении 5'-конца от повреждения (слева на рис. 9.25); uvrB? разрез с другой стороны от повреждения. Длина участка между разрезами равен 12 (или 13 в случае для тиминовых димера) нуклеотидам. Далее геликаза uvrD разрушает двойную спираль между двумя разрезами, то есть удаляет поврежденный участок. Пробел, оставшуюся заполняется ДНК-полимеразой и, лигаза окончательно восстанавливает целостность цепи.