1.1 Лабораторная работа 1. Биуретовая реакция
Биуретовая реакция получила свое название от производного мочевины – биурета, образующегося при нагревании мочевины с отщеплением от нее аммиака:
Биуретовая реакция открывает в белке пептидную связь
(она имеется и в биурете). Однако эту реакцию способны давать вещества, содержащие не менее двух пептидных связей.
При добавлении к сильно щелочному раствору белка или продукту его неполного гидролиза сульфата меди, образуются комплексные соединения меди, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет. Интенсивность окраски зависит от длины пептида.
Биуретовую реакцию дают аспарагин (амид аспарагиновой кислоты) и аминокислоты гистидин, треонин и серии.
Группа, образующая пептидную связь в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной енольной форме:
При избытке щелочи происходит диссоциация ОН-группы, появляется отрицательный заряд, с помощью которого кислород взаимодействует с медью; кроме того, медь образует дополнительные координационные связи с атомами азота, участвующими в пептидной связи, путем использования их неподеленных электронных пар. Возникающий таким образом комплекс очень стабилен.
1 Цель работы - провести биуретовую реакцию, которая обнаруживает пептидные связи в белке
2 Приборы и материалы
Белок 1 %
Едкий натр 10 %
Сернокислая медь 1 %
3 Описание работы
К пяти каплям 1 % раствора белка прибавляют три капли 10 % раствора едкого натра, одну каплю 1 % раствора сернокислой меди и перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовый цвет.
Нельзя добавлять избыток сернокислой меди, поскольку синий осадок меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.
4 Контрольные вопросы
Наличие какой связи в молекуле белка обеспечивает протекание данной цветной реакции?
Все ли белки дают данную цветную реакцию
От чего зависит интенсивность окраски в биуретовом методе?
1.2 Лабораторная работа 2. Нингидриновая реакция на α-аминокислоты
Растворы белка, пептидов и аминокислот дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином при нагревании. Все аминокислоты можно рассматривать как С-замещенные производные аминоуксусной кислоты. При окислении они расщепляются:
В качестве окислителей можно применить органическое соединение - нингидрин (трикетогидринденгидрат):
Трикетогидринден Нингидрин
Сначала нингидрин восстанавливается аминокислотой до ендиола:
1.
Декарбоксилирование
2. Дезаминирование
3. Окисление
Ендиол
Затем конденсируется с аммиаком и второй молекулой нингидрина, образуя краситель типа мурексида (пурпурный Руэмана), который в нейтральных и слабощелочных растворах существует в виде окрашенного иона (аниона). Окраска обусловлена наличием в сине-фиолетовом Руэмана цепи конъюгации с ионными зарядами по концам цепи:
В настоящее время нингидриновая реакция исключительно широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для их количественного определения.
Сине-фиолетовый Руэмана на хроматограмме довольно быстро (в течение нескольких дней) разрушается. Чтобы избежать обесцвечивания пятен на хроматограмме, ее протаскивают через насыщенный раствор азотнокислой меди в 90 % ацетоне. При этом сине-фиолетовый Руэмана превращается в комплексную медную соль красного цвета. В таком виде, хроматограмма может храниться несколько месяцев.
1 Цель работы - провести качественную реакцию с нингидриновым реактивом на α-аминокислоты
2 Приборы и материалы
Водяная баня
Электроплитка
Белок 1 %
Гидролизат белка
Аминокислота 2 %
Нингидрин 0,1 %
3 Описание работы
В 1-ю пробирку наливают пять капель 1 % раствора белка, во 2-ю – пять капель гидролизата белка, в 3-ю – 2 мл 2 % раствора аминокислоты. Во все три пробирки наливают пять капель 0,1 % водного раствора нингидрина и кипятят 1 – 2 мин. Наблюдают появление розово-фиолетового или сине-фиолетового окрашивания. Затем раствор синеет.
4 Контрольные вопросы
Что выявляет нингидриновая реакция?
В чем принцип метода?