2.7 Лабораторная работа 18. Количественное определение белка в культуральной жидкости

Метод относится к числу пороговых и основан на том экспериментально установленном факте, что растворы, содержащие 0,0033 % белка, при наслаивании на концентриро­ванную азотную кислоту в конце второй минуты образуют на поверхности раздела жидкостей едва заметную белковую пленочку. При меньших концентрациях белка в растворе осаждения белка не происходит.

Пользуясь различными разведениями исследуемой куль­туральной жидкости, устанавливают максимальное разведе­ние, при котором белок может быть обнаружен при наслаи­вании на концентрированную азотную кислоту. Зная степень разведения, при которой концентрация белка равна 0,0033 %, вычисляют концентрацию белка в неразведенной культураль­ной жидкости.

1 Цель работы – определить количество белка в исследуемой жидкости, используя метод осаждения белка азотной кислотой

2 Приборы и материалы

Белок 1 %

Азотная кислота (конц.)

Дистиллированная вода

Исследуемая культуральная жидкость (задача)

3 Описание работы

Готовят ряд последовательных разведений. В семь про­бирок наливают по 2 мл дистиллированной воды. В 1-ю про­бирку наливают 2 мл исследуемого раствора культуральной жидкости и перемешивают. 2 мл смеси переносят во 2-ю пробирку и т. д. Из 7-й пробирки 2 мл смеси выливают. С со­держимым каждой пробирки проделывают реакцию наслаи­вания на азотную кислоту (см. лабораторную работу 15). Для этого в семь других пробирок наливают по 2 мл концен­трированной азотной кислоты. В 1-ю пробирку осторожно из пипетки наслаивают раствор белка из 1-й пробирки с белком и т.д. Пробирки не встряхивать.

Отмечают, при каком разведении появляется едва за­метное кольцо между 2-й и 3-й минутами.

4 Оформление результатов работы

Производят расчет содержания белка в 1 мл неразведенной культуральной жид­кости (задачи).

5 Контрольные вопросы

На чем основан данный метод определения белка в культуральной жидкости?

2.8 Лабораторная работа 19. Высаливание белков

Высаливанием называется процесс выделения белков из водных растворов нейтральными растворами концентрированных солей щелочных и щелочноземельных металлов: Na₂S0₄, (NH₄)₂S0₄, MgS0₄, NaCl и др.

При добавлении достаточно больших концентрации этих солей к раствору белка происходит дегидратация белковых частиц и снятие заряда; при этом белки выпадают в осадок. Степень выпадания белков в осадок зависит от ионной силы раствора осадителя, размера частиц белковой молекулы, ве­личины ее заряда, гидрофильности. Разные белки осажда­ются при различных концентрациях солей. Так, например, глобулины легче выпадают в осадок, чем альбумины. По­этому в осадках, полученных путем постепенного повышения концентрации солей, отдельные белки находятся в различ­ных фракциях. Для разделения белков этим методом широко используют сульфат аммония. Некоторые белки выпадают в осадок уже при концентрации соли, близкой к 1/10 от насы­щения, глобулины – при полунасыщении, альбумины – при полном насыщении. В насыщенном растворе сульфата аммо­ния все белки выпадают в осадок.

Высаливание белков является обратимым процессом, и после удаления соли белок вновь приобретает природные свойства. Поэтому в научно-исследовательской работе выса­ливанием пользуются при изолировании, очистке различных белков (ферменты, гормоны, и т. д.) из биологического ма­териала (клетки, растения, ткани), для получения некоторых белковых препаратов.

1 Цель работы – с помощью метода высаливания выделить яичный глобулин и альбумин