§ 4. Молекулярно-генетический метод.

Реакция гибридизации ДНК и РНК (реакция генных зондов). Последовательность нуклеотидов ДНК и РНК является уникальной не только для каждого гена, но и для геномов всех живых существ, в том числе и вирусов. Любой участок ДНК и РНК можно идентифицировать с абсолютной специфичностью с помощью комплементарной копии ДНК или РНК, которые мечены радиоактивной или калориметрической меткой. Такие меченные фрагменты ДНК и РНК называют соответственно ДНК- и РНК-зондами. Способ получения зондов состоит из следующих этапов: 1. Денатурация молекул ДНК или РНК на 2 отдельные нити при температуре 100˚С или обработке водным раствором щелочи. 2. Гибридизация или ренатурация однониточных ДНК и РНК – то есть образование второй нити ДНК или РНК, идентичной исходной при длительной экспозиции при 65˚С. Реакция гибридизации может происходить между любыми двумя однониточными нуклеиновыми кислотами (ДНК-ДНК, ДНК-РНК, РНК-РНК) в том случае, если они имеют комплементарные нуклеотидные последовательности. Реакция гибридизации может происходить как в жидкой среде, так и на твердом носителе. 3. Ферментативное нарезание ДНК или РНК на фрагменты и разделение последних на фракции путем электрофореза на твердом носителе. 4. Нанесение метки на фрагменты ДНК и РНК.

ДНК- и РНК-зонды получены для большинства вирусов, патогенных для человека. С помощью генных зондов проводят идентификацию ДНК и РНК в клиническом материале, выявляют интегрированные последовательности ДНК-провируса, определяют вирусоспецифические ДНК в эписомальной форме, а также различные варианты вирусов с эпидемиологической целью. Реакция молекулярной гибридизации является высокочувствительной, позволяющей выявить нуклеиновые кислоты в таких низких концентрациях, как 1-10 пг.

Реакцию генных зондов проводят следующим образом. Выделенные из клинического материала ДНК и РНК денатурируют и наносят на нитроцеллюлозную мембрану. Затем добавляют ДНК- и РНК-зонды, выдерживают некоторое время, после чего несвязавшиеся реагенты удаляют многократным отмыванием. В случае использования зондов с радиоактивной меткой регистрацию результатов исследования проводят на γ-счётчике. Если зонды были мечены ферментом (пероксидазой или щелочной фосфатазой), то к такому зонду добавляют субстрат, ферментация которого сопровождается изменением окраски, видимой невооружённым глазом.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Принцип реакции состоит в многократном копировании изучаемой ДНК ферментом ДНК-полимеразой, после чего образовавшиеся копии ДНК идентифицируют методом электрофореза. ПЦР проводится в несколько этапов: 1. Термическая денатурация двухниточной молекулы ДНК на единичные нити. 2. Внесение праймеров – 10-20 нуклеотидных последовательностей, взаимодействующих с окончаниями однониточных ДНК. 3. Внесение ДНК-полимеразы, запускающей образование вторичных копий нитей ДНК на матрице однониточных ДНК. 4. Термическая денатурация образовавшихся двухниточных копий ДНК. 5. Внесение праймеров. Денатурацию и праймирование повторяют многократно до получения достаточного количества изучаемой ДНК. 6. Нанесение копий ДНК на мембрану с ДНК-зондами и проведение электрофоретического раздражения исследуемой ДНК. 7. Регистрация результатов исследования калориметрическим способом. Идентификация копий ДНК проводится по известному ДНК-зонду.

ПЦР позволяет идентифицировать ДНК даже в том случае, если в распоряжении исследователя имеется всего лишь одна исходная молекула геномной ДНК.

123