§ 3. Серологический метод диагностики.

Название метода происходит от латинского слова serum – сыворотка, так как основным материалом для исследования этим методом является сыворотка крови больного. Цель серологической диагностики – обнаружение в сыворотке крови специфических противовирусных антител к известному вирусному антигену (диагностикуму). При серологическом методе диагностики вирусных заболеваний используются РТГА, РСК, РПГА, ИФА, РИА, Известным компонентом данных реакций являются вирусные антигены, которые либо вносятся в жидкую фазу при постановке реакции (РТГА, РСК, РПГА), либо адсорбированы на твердой фазе полистироловых планшетов (ИФА, РИА). Серологический метод используется для диагностики многих вирусных заболеваний, а также для контроля уровня иммунитета и массовых экологических исследований.

РТГА. Осуществляется в пробирках или планшетах. Сыворотки больного двукратно разводят в солевом растворе от 1:10 до 1:640, после чего вносят в каждое разведение равные объёмы диагностикума и проводят экспозицию в течение 1 ч при 37˚С. Затем добавляют по 0,4 мл взвеси эритроцитов и вновь инкубируют при тех же условиях. Параллельно проводят контроль диагностикума и эритроцитов (табл. 3).

Таблица 3

Схема постановки РТГА для выявления противовирусных антител

Ингредиенты	Количество ингредиента при разведении диагностикума, мл							Контроль
	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	диагностикума	эритроцитов
Солевой раствор, мл	-	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,4
Исследуемая сыворотка 1:10	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	-
Вирусный диагностикум	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	-	-
Экспозиция 1 ч при 37˚С
Взвесь эритроцитов	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4
Экспозиция 1 ч при 37˚С
Учёт

Примечание: (+) – наличие гемагглютинации, (-) – отсутствие гемагглютинации. Титр противовирусных антител в исследуемой сыворотке 1:160.

Если в исследуемой сыворотке присутствуют антитела к используемому вирусному диагностикуму, то произойдет блокада вирусных гемагглютиногенов антителами сыворотки и агглютинации эритроцитов не произойдет (реакция положительна). При отсутствии в сыворотке специфических противовирусных антител, либо при их низкой концентрации агглютиногены диагностикума блокированными антителами не будут, что вызовет агглютинацию эритроцитов (реакция отрицательна).

При однократном исследовании сыворотки крови больного в РТГА этиологический диагноз по результатам реакции выставляется в случае диагностического титра, или титра, его превышающего. Для каждого вирусного инфекционного заболевания принят свой диагностический титр, то есть наименьший титр антител в сыворотке крови, выявление которого дает право постановки соответствующего этиологического диагноза при однократном серологическом исследовании. Для более точной серологической диагностики вирусных инфекций РТГА проводят в парных сыворотках, одну из которых берут в начале заболевания (при поступлении в стационар), а вторую – через 7-10 дней после первой. Увеличение титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой в 4 раза и более подтверждает этиологический диагноз.

РТГА позволяет дифференцировать противовирусные антитела по классам, в частности, обнаруживать Ig M и G. С этой целью сыворотку крови больного делят на 2 порции, одну из которых обрабатывают химическим реагентом, избирательно разрушающим Ig M (цистеина гидрохлорид), или адсорбирующим Ig G (белок А Staphylococcus aureus штамма Cowan). Постановка РТГА в этом случае не отличается от приведенной выше и заключается в параллельном титровании предварительно обработанной и необработанной порций сыворотки крови больного.

Если в исследуемой сыворотке после ее обработки цистеина гидрохлоридом титр антител снижается пол сравнению с необработанной сывороткой, то это свидетельствует о присутствии антител класса Ig M. Следовательно, больной переносит острую форму вирусного заболевания, поскольку Ig М образуются при первичном иммунном ответе. Напротив, обнаружение в исследуемой сыворотке антител класса Ig G будет свидетельствовать о вторичном иммунном ответе. При этом в зависимости от наличия или отсутствия клинических симптомов болезни присутствие антител класса Ig G может быть расценено как хроническое течение вирусного заболевания, либо как полное выздоровление.

РСК. Наряду с идентификацией вирусов, РСК используется для серологической диагностики вирусных заболеваний. В последнем случае известным компонентом является вирусный диагностикум, посредством которого пытаются выявить специфические антитела в сыворотке крови обследуемого. РСК проводится с парными сыворотками крови. Первую сыворотку разводят 1:4-1:128, вторую – 1:8-1:256. Дальнейшее исследование проводят согласно табл. 4. Проводят также контроль специфической, неспецифической сывороток, а также диагностикума и комплемента.

Таблица 4

Схема постановки РСК для выявления противовирусных антител в парных сыворотках

Ингредиенты		Количество ингредиента при разведении диагностикума, мл
		1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128
		1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256
Первая сыворотка		0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Вторая сыворотка		0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Диагностикум		0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Комплемент		0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Экспозиция 18-20 ч при 4˚С
Гемолитическая система		0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Экспозиция 45 минут при 37˚С
Учет	Первая сыворотка	++++	+++	++	+	-	-
	Вторая сыворотка	++++	++++	++++	+++	+++	+++

За титр сыворотки принимают то наибольшее ее разведение, которое задерживает гемолиз не менее чем на «++». Если разность в титрах антител первой и второй сывороток крови больного составляет 4 раза и более, можно считать, что заболевание было связано с соответствующим вирусом. В РСК можно исследовать единичные сыворотки больного на выявление Ig М.

РПГА (РНГА). Реакция обладает более высокой чувствительностью, чем РСК. Широко используется для серологической диагностики кори, респираторно-синцитиальной, Коксаки В и аденовирусной инфекций, бешенства, клещевого энцефалита. Известным компонентом реакции является вирусный антиген, адсорбированный на эритроцитах барана. Склеивание эритроцитов происходит только при наличии в сыворотке крови обследуемого специфических противовирусных антител. РПГА выполняют микрометодом. Исследуемые парные сыворотки разводят от 1:10 до 1:5120, вносят эритроцитарный диагностикум, инкубируют 2 часа при 37 ˚ С, после чего проводят учет по общепринятой плюсовой системе. В РПГА используют 2 вида контроля: контроль диагностикума на специфическую и неспецифическую гемагглютинацию (табл. 5).

Титром антител исследуемой сыворотки крови считается то наибольшее её разведение, в котором выраженность реакции гемагглютинации «++». Если в парных сыворотках регистрируется прирост антител к используемому антигену в 4 раза и более, то можно считать, что обследуемый перенес данную инфекцию.

Таблица 5

Схема РПГА для определения прироста антител к вирусу кори в парных сыворотках

Ингредиенты, мл	Опытные пробирки
	1	2	3	4	5	6
Изотонический раствор натрия хлорида, мл	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Сыворотка больного	1:10	1:20	1:40	1:80	1:160	1:320
На 3 день болезни 1-я	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
На 12 день болезни 2-я	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Диагностикум эритроцитарный коревой	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Экспозиция 2-4 ч при комнатной температуре или 2 ч при 37˚С в термостате
Учет
1-я сыворотка
2-я сыворотка

Иммуноферментный анализ (ИФА). Основное отличие иммуноферментных тест-систем, предназначенных для серологической диагностики вирусных заболеваний, состоит в том, что на твердой фазе адсорбированы вирусоспецифические антигены, а не вирусоспецифические антитела, как это имеет место в иммуноферментных тест-системах, используемых для идентификации вирусов. Последовательность постановки ИФА по выявлению в сыворотке крови обследуемого антител к вирусным антигенам представлена в табл. 6.

Таблица 6

Схема постановки ИФА для выявления противовирусных антител

Последовательность выполнения ИФА	№ лунки полистиролового планшета
	КПС	КОС	КК	Исследуемая сыворотка 1	Исследуемая сыворотка 2
Сорбированный очищенный антиген инактивированного ВИЧ	+	+	+	+	+
Исследуемая сыворотка в разведении 1:100	+	+	+	+	+
Инкубация	+	+	+	+	+
Отмывка лунок	+	+	+	+	+
Антитела против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой	+	+	+	+	+
Инкубация и отмывка	+	+	+	+	+
Субстрат для выявления иммуноферментного комплекса	+	+	+	+	+
Измерение показателя оптической плотности	0,4	0,1	0,05	0,2	0,7
Заключение				-	+

При оценке результатов ИФА учитывают 2 параметра: активность тест-системы и нижнюю границу оптической плотности положительных проб (ОП погрешности). Активность тест-системы определяют по формуле: средняя ОП КПС/средняя ОП КОС >3, то есть тест-система является пригодной для использования, если средний показатель оптической плотности контрольной положительной сыворотки (ср. ОП КПС) превышает средний показатель оптической плотности контрольной отрицательной сыворотки (ср. ОП КОС) в 3 раза и более. При этом средний показатель ОП КОС не должен превышать 0,3, а контроля конъюгата (КК) – 0,1. Положительной считают ту исследуемую сыворотку крови, показатель ОП которой превышает показатель ОП погрешности, равный ОП КОС + 0,2.

Модификацией ИФА является метод иммуноблота. Вначале физико-химическими способами проводят разрушение вирусов на составляющие их белки, гликопротеины и гликолипиды, которые затем фракционно разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. После этого проводят электрофоретический перенос вирусных белков из геля на нитроцеллюлозную бумагу. Поскольку электрофоретическая подвижность вирусных белков различна, они располагаются на нитроцеллюлозной бумаге фракционно. Благодаря этому становится возможной идентификация антител сыворотки крови к индивидуальным белкам (антигенам) вирусов. Для этого на нитроцеллюлозные полоски наносят исследуемую сыворотку, проводят инкубацию и отмывку. После этого полоску обрабатывают антителами против иммуноглобулинов человека и вновь инкубируют и отмывают. На завершающем этапе наносят субстрат для выявления иммуноферментного комплекса. Положительная реакция в иммуноблоте выявляется в виде окрашенных полос на нитроцеллюлозной мембране. По специфичности вирусных белков определяют специфичность сывороточных антител. Метод иммуноблота широко используется для диагностики ВИЧ-инфекции.

Радиоиммунный анализ (РИА). Является высоко чувствительным и высоко специфичным способом серологической диагностики вирусных заболеваний. РИА проводится не на твердой фазе, а в растворе, что обеспечивает большую доступность всех антигенных детерминант для взаимодействия с антителами.

В основе РИА лежит реакция радиоиммунопреципитации – РИП. В качестве вирусных антигенов используются меченные радионуклидами белки вирусов, которые метят I¹²⁵ или S³⁵ при выращивании вирусов в чувствительных клетках в присутствии радиоактивно меченных аминокислот. Выделяют следующие этапы РИП. 1. Смешивание меченных структурных вирусных белков с исследуемой сывороткой с целью образования иммунных комплексов антиген-антитело. 2. Выделение иммунных комплексов из раствора путем преципитации с гранулами сефарозы и белка А Staphylococcus aureus с последующим центрифугированием. 3. Диссоциация иммунных комплексов с помощью детергентов и электрофорез в полиакриламидном геле. 4. Проведение авторадиографии геля для определения подвижности и молекулярной массы вирусных белков. Таким образом, определяют, какие именно вирусные белки оказались в составе иммунных комплексов с антителами и, следовательно, антитела, к каким именно белкам вируса присутствуют в исследуемой сыворотке крови. РИП как экспертный метод используется для диагностики ВИЧ-инфекции.