Учет рн по цпд и цветной пробе при идентификации вирусов

	РН «-» красный цвет	РН «+» жёлтый цвет
Вирус не нейтрализован диагностической противовирусной сывороткой		Вирус нейтрализован диагностической противовирусной сывороткой

Если антигены выделенных вирусов соответствуют антителам диагностической сыворотки, то вирусы инактивируются и не вызывают инфицирования клеток культуры (ЦПД отсутствует). Живые незараженные вирусом клетки, выделяя кислые метаболиты, вызывают изменение цвета среды с малинового на желтый. В этом случае РН считается положительной, а выделенный вирус идентифицируется по диагностической сыворотке. При развитии ЦПД и сохранении красного цвета в среде культивирования клеточной культуры, РН считается отрицательной, а выделенные вирусы – неидентифицированными.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) используется для идентификации вирусов, имеющих поверхностный антиген – гемагглютинин, способный вызывать агглютинацию эритроцитов. Гемагглютинин содержат вирусы гриппа, парагриппа, бешенства, аденовирусы и др. Вирусные гемагглютинины видо- и типоспецифичны. Механизм РТГА заключается в том, что диагностические антитела - антигемагглютинины препятствуют вирусам агглютинировать эритроциты чувствительных видов животных.

В пробирках в изотоническом растворе натрия хлорида готовят двукратные разведения диагностической сыворотки (1:10, 1:20 и т.д.). Затем в каждую пробирку вносят равное количество вируссодержащей жидкости, в которой находится 4 ГАЕ вируса. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч, после чего в каждую пробирку вносят равный объем 1 % суспензии эритроцитов. Смесь инкубируют повторно 30-60 минут при 22˚С и учитывают результаты реакции. Если вирусные гемагглютинины гомологичны антителам сыворотки, то вирус утрачивает способность склеивать эритроциты. В РТГА это происходит до тех пор, пока количество антител будет достаточным для блокады вирусных гемагглютининов. При недостатке антител агглютинирующая способность вирусов восстанавливается. Титром сыворотки называется ее наибольшее разведение, которое тормозит гемагглютинацию.

Таким образом, РТГА считается положительной, если торможение гемагглютинации наступает, а выделенный вирус типируется по диагностической сыворотке.

Напротив, если вирусные гемагглютинины не гомологичны антителам диагностической сыворотки, то вирус не утрачивает способности склеивать эритроциты. В этом случае РТГА считается отрицательной, а выделенный вирус – не идентифицированным (табл. 2).

Таблица 2.

Учет ртга при идентификации вирусов

Противогриппозная сыворотка А	Гемаглютинины блокируются антителами							РТГА «+»
Противогриппозная сыворотка В								РТГА «-»
	Гемаглютинины не блокируются антителами

Реакция торможения гемадсобции (РТГадс). Используется для идентификации гемадсорбирующих вирусов. Для этого диагностическую сыворотку в разведении 1:5 и количестве 0,2 мл вносят в пробирки с вирусинфицированной клеточной культурой, выдерживают в течение 30-60 минут и добавляют 0,2 мл 0,5 % взвеси эритроцитов. Пробирки инкубируют 20-30 минут при температуре, оптимальной для гемадсорбции выделяемого вируса. Если антигены вируса гомологичны антителам сыворотки, то вирусы утрачивают способность адсорбировать эритроциты на поверхности клеток культуры. В этом случае РТГадс считается положительной, а выделяемый вирус идентифицируется по диагностической сыворотке. При негомологичности вирусных антигенов антителам диагностической сыворотки эритроциты адсорбируются на клетках, словно РТГадс отрицательная, а вирус не идентифицирован.

Реакция пассивной (или непрямой) гемагглютинации (РПГА или РНГА). Для идентификации вирусов в РПГА (РНГА) используется эритроцитарный антительный диагностикум. То есть на эритроцитах находятся фиксированные Fc-концом антитела, антигенсвязывающие детерминанты которых остаются свободными и способны взаимодействовать с гомологичным антигеном.

Реакцию осуществляют путем смешивания равных объемов вируссодержащей жидкости и эритроцитарного антительного диагностикума, с последующей их инкубацией при 37˚С в течение 30 минут.

При гомологичности антигенов вирусов антителами диагностикума происходит агглютинация эритроцитов – реакция считается положительной, а вирус идентифицируется по антительному диагностикуму. При несоответствии вирусных антигенов антителам агглютинация не наступает – реакция считается отрицательной, а вирус – не идентифицированным.

Реакция связывания комплемента (РСК). Используется для идентификации адено-, герпес-, ортомиксо-, парамиксо-, арена-, бунья-, рота- и тогавирусов. В реакции участвует 2 системы: диагностическая и индикаторная. Диагностическую систему составляют: 1) неизвестные вирусы, которые необходимо идентифицировать; 2) специфическая (диагностическая) иммунная сыворотка; 3) комплемент. Индикаторную систему составляют: 1) эритроциты барана; 2) гемолитическая иммунная сыворотка, вызывающая гемолиз эритроцитов при наличии свободного комплемента.

Пробирку заполняют равными количествами компонентов диагностической системы и инкубируют в течение 45 минут при 37˚С. Затем в пробирку добавляют индикаторную систему и выдерживают в термостате при 37˚С 30 минут, после чего производят учет реакции.

Если антигены идентифицируемых вирусов окажутся гомологичными антителам диагностической сыворотки, то образуется комплекс антиген-антитело, но поскольку свободного комплемента нет, гемолиза эритроцитов не происходит и они оседают на дно пробирки. В этом случае РСК считается положительной, а неизвестный вирус идентифицируется по диагностической сыворотке.

Если антигены идентифицируемых вирусов негомологичны антителам диагностической сыворотка, то комплекс антиген-антитело не образуется и комплемент остается в несвязанном состоянии. Он взаимодействует с комплексом антиген-антитело, образованным компонентами индикаторной системы. Вследствие этого происходит гемолиз эритроцитов. В этом случае РСК считается отрицательной, а неизвестный вирус остается не идентифицированным.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Относится к твердофазным иммуносорбентным методам исследования. В качестве твердофазного носителя в ИФА используются планшеты, пробирки, пленки из полистирола, который обладает высокой сорбционной способностью. Для идентификации вирусов известный компонент реакции – антитело сорбируют на твердую фазу. Затем вносят вируссодержащий материал и инкубируют. Если антигены вирусов гомологичны антителам, то образовавшийся комплекс не будет удален при отмывке твердой фазы. После отмывки вносят противовирусные или антивидовые антитела, меченные ферментом, которые взаимодействуют с вирусными антигенами в случае их гомологичности. Для визуализации реакции добавляют субстрат – хромоген, способный изменять цвет среды под действием фермента. Результаты ИФА учитывают с помощью приборов (ридеров) по интенсивности окрашивания хромогена. При положительном результате ИФА вирусы идентифицируют по использованным диагностическим антителам.

Радиоиммунный анализ (РИА). Представляет собой разновидность твердофазного иммуносорбентного метода исследования. Методика проведения РИА аналогична методике постановки ИФА, за исключением 2 конечных этапов. В отличие от ИФА, в РИА используют противовирусные антивидовые антитела, меченные не ферментом, а радионуклидом (обычно I¹²⁵), а учет результатов проводят с помощью счетчиков радиоактивности (γ-счетчиков).