3.5.2. Ферменти фолдинга

3.5.2.1. Протеиндисульфидизомераза

Одна з двох фолдаз вже згадувалася в п. 3.4.3.4: це протеїндисульфідизомераза, або ПДІ.

Там же було сказано, що цей фермент каталізує переміщення в білках дисульфідних зв'язків. Це означає, що під його впливом в білку, що згортається, розриваються одні і замість них замикаються інші дисульфідні зв'язки.

Що було б у відсутність ПДІ? Допустимо, в білці, як в РНКазі Анфінсена, 8 залишків цистеїну, що допускає 105 різних комбінацій замикання між ними 4-х дисульфідних зв'язків (п. 3.4.2.1). З цих комбінацій тільки одна є "правильною".

Так от, без ПДІ замикання тих, що перших попалися, 4-х дисульфідних зв'язків, по суті, назавжди зафіксувало б пептидний ланцюг у відповідній конформації, навіть якщо остання була б дуже далека від нативної і енергетично дуже невигідною. Дійсно, дисульфідні зв'язки є ковалентними, тому для їх розриву необхідно подолати високий кінетичний бар'єр.

Саме наявність такого бар'єру, як відомо, робить стабільними дуже багато енергоємних речовин.

Можливість фіксації білку в "неправильній" конфігурації "неправильними" дисульфідними зв'язками показав ще у своїх експериментах з РНКазою Анфінсен.

Як описувалося в п. 3.4.2.1, денатурацію РНКази він здійснював двома агентами - сечовиною (що розриває слабкі зв'язки) і Р-меркаптоетанолом (що розриває дисульфідні зв'язки), а ренатурацію, або рефолдинг, спостерігав, одночасно видаливши з середовища обидва ці агента.

Зовсім інший результат виходив, якщо спочатку видаляли тільки Р-меркаптоетанол (мал.нижче).

В цьому випадку (тобто при наявності сечовини) слабкі зв'язки не сприяли формуванню нативної конформації. Тому при повільному замиканні дисульфідних зв'язків (шляхом окислення SН-груп цистеїну киснем повітря) з рівною ймовірністю утворювалися білкові молекули з усіма 105 комбінаціями розподілу дисульфідних зв'язків. Тобто на 1 молекулу з правильною конфігурацією виходило 104 «неправильних» молекул.

Еоли потім видаляли із середовища і сечовину, конформація молекул не змінювалась: вона була вже зафіксована дисульфід ними зв’язками. РНКазна активність сумарного продукта була лище біля 1/105 = 1%.

Але цю активність можна було знову довести до повної, якщо додати слідові кількості β-меркаптоетанола. Вони сприяли розриву в білкових молекулах існуючих дисульфід них зв’язків і перешкоджали утворенню інших дисульфід них зв’язків. Тобто ці кількості агенту служили каталізаторами перерозподілу, або переміщення, дисульфід них зв’язків. Інакше кажучи, вони відіграли ту ж роль, яку виконує в клітині ПДІ.

Таким чином, лабілізація (чи ізомеризація) дисульфідних зв'язків в білку, що формується, дає йому можливість знайти (шляхом випадкового перебору) таку комбінацію цих зв'язків, якій відповідає енергетично найбільш оптимальна просторова структура.

З наведеного експерименту ясно також, що необхідність в ПДІ при фолдингутого або іншого білку пов'язана не з розміром цього білку, а з кількістю в нім дисульфідних містків.

У клітині ПДІ пов'язана, в основному, з ендоплазматичною сіткою (ЕПС). З цього виходить, що особливо велика її роль у формуванні тих білків, які синтезуються мембранозв’язаними рибосомами. Це, згідно п. 3.1, "експортні", мембранні і лізосомальні білки. У багатьох з них містяться дисульфідні містки.

Окрім дисульфідізомеразної активності, ПДІ має здатність до неспецифічного зв'язування пептидів в стехіометричних концентраціиях. Таку ж здатність мають типові шаперони. На цій підставі деякі автори роблять висновок, що ПДІ функціонує не лише як ПДІ, але і як шаперон.

Цього вистачало б природно: адже пошук "правильних" дисульфідних містків і утворення "правильних" слабких зв'язків - дві сторони одного і того ж процесу, розділити які дуже важко. Одне сприяє іншому і навпаки.

Одним з доказів шаперонної ролі ПДИ служить та обставина, що in vitro вона сприяє фолдингу білків, які не містять дисульфідних містків.