3.4.1.4. Четвертинна структура

Про наявність у білку четвертинної структури говорять тоді, коли він складається з декількох субодиниць. Прикладом є гемоглобін, молекула якого включає 4 субодиниці двох видів (п. 2.4.1.3).

Субодиниці зв'язуються за рахунок взаємодії амінокислотних радикалів, що знаходяться на контактуючих поверхнях субодиниць. Ці поверхні по розташуванню даних радикалів є взаємно комплементарнимим. Вони нерідко збагачені гідрофобними і різнойменно зарядженими радикалами.

Таким чином, зв'язування субодиниць може проходити лише після утворення третинної структури.

З іншого боку, це зв'язування само позначається на третинній структурі субодиниць : доводить її до функціонально активного або, навпаки, неактивного стану. Тому такі білки зазвичай активні лише в олігомерній формі (як гемоглобін) або, навпаки, тільки в дисоційованому стані (як деякі протеінкінази).

У останньому випадку одні субодиниці служать для гальмування активності інших і диссоціюють під впливом спеціального сигналу (циклічного АМФ).

3.4.2. Чинники, що визначають просторову структуру білку

3.4.2.1. Роль первинної структури

Ми вже говорили (п. 3.4.1.2), що первинна структура білкаповністю визначає вторинну структуру різних його фрагментів. Те ж саме можна сказати і відносно більш високих структур - третинної і четвертинної.

Це було показано К. Анфінсеном в 1973 р. в класичному експерименті з рибонуклеазою (мал. 3.19).

Ця РНКаза складається з одного пептидного ланцюга, що включає 124 амінокислотні залишки. Серед останніх - 8 залишків цистеїну (Цис), які утворюють попарно 4 дисульфідні зв'язки.

Принциповий момент: усього може бути 105 комбінацій таких попарних взаємодій; у кожній з них n = 8 залишків Цис утворюють один з одним 4 дисульфідні зв'язки. (Згідно комбінаториці, кількість цих комбінацій розраховується як добуток непарних чисел до n: в даному випадку 3x5x7=105.)

З усіх комбінацій в нативній РНКазі реалізується тільки одна - і строго визначена: 26-84, 40-95, 58 110, 65-72 (цифри вказують положення залишків Цис у витягнутій поліпептидному ланцюгу). Як видно, в більшості випадків взаємодіючі радикали Цис знаходяться в пептидному ланцюзі досить далеко один від одного.

Окрім дисульфідних, в третинній структурі РНКази є і інші зв'язки - зокрема, водневі.

Так, на першій стадії експеримента в середовищі з РНКазою вносили два компоненти:

• сечовину, яка розриває водневі і, можливо, інші слабкі зв'язки,

• а також агент (β-меркаптоетанол), що зворотньо розриває дисульфідні зв'язки.

При цьому нативна структура РНКази руйнувалася і пептидний ланцюг починав утворювати випадковий клубок. Ферментативна активність зникала у зв'язку з руйнуванням активного центру. Таким чином, білок був приведений в приблизно такий стан, який він мав відразу після трансляції, тобто до фолдинга.

На другій стадії експерименту обидва названі агенти з середовища видаляли (шляхом діалізу). І з часом у білку знову з'являлася ферментативна (тобто РНКазна) активність.

Отже, відновлювалася нативна структура білку: знову замикалися дисульфідні зв'язки, причому між тими ж парами радикалів Цис; і знову утворювалися слабкі зв’язки. Якщо користуватися сучасною мовою, відбувався рефолдинг РНКази.

Цей результат справив глибоке враження і на автора експерименту, і на наукове співтовариство. Було зроблено два ключових висновки.

1) Уся інформація про третинну структуру білку (по крайній мірі, якщо він не має небілкового компонента) знаходиться в його первинній структурі, тобто в послідовності амінокислот в пептидному ланцюзі.

Зараз це здається само собою зрозумілим, але, взагалі кажучи, могло бути і інакше. Могли існувати спеціальні інструктивні молекули, які, накладаючись на випадковий клубок (як на воскову заготівлю), цілком визначали б просторову структуру білку.

Ця ідея довгий час лежала в основі одній з гіпотез імуногенезу, яка так і називалася - інструктивною. Малося на увазі, що антигени таким чином призводять до появи специфічних до них антитіл.

Експерименти ж Анфінсена показали, що білок приймає строго певну конфігурацію без яких-небудь "Інструкторів" - на основі тільки фізико-хімічних взаємодій своїх хімічних груп.

Але і ідея про інструктивну роль інших речовин також знайшла своє підтвердження! Тільки не у первинному, а в істотно модифікованому виді. Мається на увазі вже згадуваний факт, що на третинну структуру білку можуть впливати його ліганди, а також хімічна модифікація.

У зв'язку з цим можна згадати популярну теорію індукованої відповідності. Згідно з нею, у відсутність субстрату активний центр ферменту ще не до кінця сформований. Субстрат же в процесі зв'язування індукує такі переміщення радикалів активного центру, які як би "підганяють" структуру цього центру під структуру субстрату.

2) Другий висновок, що виходив з дослідів Анфінсена, полягав в тому, що білок не лише "знає", яку третинну конформацію прийняти, але і робить це цілком самостійно. Дійсно, відновлення нативної структури РНКази відбувалося у відсутність яких-небудь агентів, тобто самовільно.

Цей висновок був поширений на усі білки і довгий час теж вважався цілком очевидним.

І лише не так давно стало з'ясовуватися, що він справедливий, мабуть, тільки для невеликих білків, до яких відноситься і рибонуклеаза Анфінсена.

Для фолдинга ж великих білків потрібні спеціальні білки - шаперони (згадувані в п. 3.1) і ферменти фолдази. Вони не визначають те, яка має бути просторова конфігурація білку (тобто не являються "інструкторами"), але створюють можливість для швидкого її формування.

Детальніше про фолдази і шаперони мова піде в розділі 3.5.

Таким чином, первинна структура пептидного ланцюга відіграє визначальну роль у фолдингу цього ланцюга, але вона не завжди виявляється достатньою для забезпечення фолдинга або (і) його остаточного завершення.