Определение глюкозы в крови

Мотивация. Для диагностики целого ряда заболева­ний (сахарный диабет, патологические состояния, связан­ные с недостаточностью функции печени и почек, некото­рые эндокринные заболевания, новообразования мозга, поджелудочной железы и надпочечников, гиповитаминоз В₁) важно иметь объективное представление о состоянии углеводного обмена у больных, одним из показателей которого является уровень глюкозы в крови. Содержание глюкозы в крови детей, как и у взрослых, составляет 3,3-5,5 ммоль/л.

Реактивы. Ортотолуидиновый реактив; 3% раствор трихлоруксусной кислоты; основной стандартный раствор глю­козы - 5,5 ммоль/л.

Принцип. Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает зеленое окрашива­ние, интенсивность которого (прямо пропорционально концентрации глюкозы в крови) устанавливают колоримет­рически.

Ход работы. Порядок выполнения работы со­гласно схеме:

Реактивы	Контроль	Опыт	Стандарт
3% раствор трихлоруксусной кислоты	0,9	0,9	0,9
Сыворотка крови	-	0,1	-
Вода	0,1	-	-
Стандартный раствор	-	-	0,1

Смесь взбалтывают, центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин.

Реактивы	Контроль	Опыт	Стандарт
Центрифугат	0,5	0,5	0,5
Ортотолуидиновый реактив	4,5	4,5	4,5

Пробирки со смесью помещают в кипящую водяную баню на 8 мин (!), охлаждают ее под краном холодной во­дой. Колориметрируют на ФЭКе с красным или оранжевым светофильтром, длина волны 590-650 нм, в кювете с шириной слоя 10 мм.

Рассчитывают по формуле:

5,5 ^. Е оп

С оп = ---------------------

Е ст

ЕЕее

где С оп - концентрация глюкозы в опытной пробе;

5,5 - концентрация стандартной пробы;

Е оп - оптическая плот­ность опытной пробы;

Е ст - оптическая плотность раствора стандарта.

Клинико-диагностическое значение.

Увеличение концентрации глюкозы в сыворотке крови (гипергликемия) наблюдается при различных физио­логических и патологических состояниях.

1. Алиментарная гипергликемия – после обильного приема с пищей углеводов.

2. Эмоциональная (адреналовая) гипергликемия – при сильном эмоциональном и психическом возбуждении.

3. Сахарный диабет и острый панкреатит – вследствие недостатка инсулина.

4. При токсическом, травматологическом, механическом раздражении ЦНС (нервная гипергликемия) - вследст­вие избытка адреналина.

5. При повышении гормональной активности щитовидной железы, коры и мозгового слоя надпочечников, гипо­физа.

Уменьшение уровня глюкозы в крови (гипогликемия) встречается:

1. После тяжелой физической работы.

2. При передозировке инсулина (во время лечения сахарного диабета).

3. При увеличении уровня контринсулярных гормонов.

4. При нарушении всасывания углеводов в тонком кишечнике - мальабсорбции, заболевании тонкого кишечника.

5. При нарушении реабсорбции глюкозы в канальцах – при заболеваниях почек.

6. При большой кровопотери.

Глюкоза

НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИЙ ГЛЮКОЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ ЭНЗИМАТИЧЕСКИМ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОМ МЕТОДОМ

ГЛЮКОЗА - 02 – ВИТАЛЬ Кат. № В 05.02

ГЛЮКОЗА - 12 – ВИТАЛЬ Кат. № В 05.12

ГЛЮКОЗА - 32 – ВИТАЛЬ Кат. № В 05.32

Настоящий набор реагентов относится к серий «Витал – Европа», скомпонованной в соответствии с международным требованиями.

Принцип метода:

При окислений β – D – глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозооксидазы (GOD) образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы (POD) перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентраций глюкозы в крови.

Исследуемый материал:

Свежая сыворотка /плазма крови или моча. В моче целесообразно предварительно провести качественную реакцию , а количественные измерения проводить только в пробах, дающих положительную реакцию.

Состав набора.

Реагент №1. Буфер

Фосфатный буфер, рН7,5………………………………….150 ммоль/л

Фенол…………………………………………………………10 ммоль/л

Реагент №2.Лифилизат

Глюкозозооксидаза …………………………………………25 000ед/л

Переоксидаза…………………………………………………..1500ед/л

Калибратор

Глюкоза……………………………………………………10 ммоль/л

Аналитические характеристики набора:

Линейность……………………до 30 ммоль /л при соотношении реагент/образец 200/1

до 20 ммоль/л при соотношении реагент/образец 100/1

Значение коэффициента вариации………………………………………………..не более 5 %.

Время инкубаций…………………………………………20 – 25°С – 15 мин; 37°С - 10мин.

Чувствительность……………………………………………………………….0,5 ммоль/л.

Стабильность окраски……………………………………………………….не менее 1 часа.

Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность.

Срок хранения набора – 18 месяцев при 2 – 8 °С Дата изготовления, серия и номер по каталогу указаны на упаковке.

Невскрытые реагент № 1 и калибратор стабильны в течений 18 месяцев при 18 - 25°С; №2 при 2 - 8°С.

Рабочий реагент: Содержимое флакона № 2, аккуратно перемешивая, растворить в одном флаконе № 1. Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре 20 – 30 мин. Полученный реагент стабилен не менее 6 месяцев при температуре хранения 2 - 8°С Плотно закрывайте флакон сразу же после использования. Приобретенное при хранений розовое окрашивание рабочего реагента(до оптической плотности против воды не более 0,200, кювета – 1 см) не валяет на правильность определения глюкозы.

Калибратор готова к использованию. Вскрытый калибратор стабилен в течение 6 месяцев при условий достаточной герметичности флакона.

АНАЛИЗ

Качественная реакция: к 0,5 мл рабочего реагента добавьте 0,01 мл мочи. Если через 15 мин развивается розовое окрашивание – проба считается положительной и может быть использована для количественного определения глюкозы.

Количественный анализ:

Внести в пробирки	Опытная проба мл	Калибровочная проба мл	Контрольная (холостая) проба, мл
Сыворотка /плазма или моча	0,01	-	-
Рабочий реагент	2,0	2,0	2,0
Калибратор	-	0,01	-

Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 10 минут при 37°С или 15 минут при комнатной температуре (18 - 25°С). После окончания инкубаций измеряют оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной (холостой) пробы в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм ( 1см)при длине волны 510 нм (ФЭК – 490 нм)

Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубаций при предохранений от прямого солнечного света.

Расчет концентраций глюкозы проводят по формуле: С= Еоп/Екал × 10, где Еоп и Екал - экстинкций опытной пробы и калибровочной пробы. Измеренные относительно контрольной пробы.

Нормальные величины: сыворотка /плазма – 4,2 – 6,1 ммоль/л; моча – до 0,8 ммоль\л

Внимание: 1. Гемолиз до 0,124ммоль/л гемоглобина и билирубин до 324 мкмоль/л не влияет на правильность определения глюкозы. 2. При необходимости возможна увеличение объема образца до 0,02 мл (линейность до 20ммоль) или использование 0,02 мл образца, предварительно разведенного в 2 раза физиологическим раствором(лилейность до 30 ммоль/л) 3. При мытье посуды для анализа и кювет для измерения нельзя пользоваться моющими растворами, содержащими перекись водорода, а также серный(диэтиловый )эфир (например, смесью Никифорова) .4. Программы к биохимическим анализаторам доступны по запросу.

.

Занятие 4

Тема: Лабораторный практикум «Обмен липидов»

Цель: продемонстрировать клинико-диагностическую значимость количественного определения метаболитов обмена липидов в биологических жидкостях

Задачи обучения:

• Освоить методы определения содержания метаболитов липидного обмена в биологических жидкостях (сыворотке крови).

• Освоить правила интерпретации показателей липидного обмена.

Основные вопросы темы:

1. Обнаружение в количественное определение холестерина и ТАГ в плазме крови в условиях нормы и патологии

2. Определение активности пре – бета липопротеинов в биологических жидкостях в условиях нормы и патологии

3. Определение содержания кетоновых тел в моче

4. Оформление протоколов исследования

5. Обсуждение полученных результатов

Методы обучения и преподавания: проведение биохимических методик, оформление протоколов, обсуждение полученных результатов (TBL)

Литература

1. Биохимия: Учебник для мед. вузов / под ред. Е.С. Северина. - 5-е изд., испр. и доп., 4-е изд. - М. : ГЭОТАР-МЕД, 2009,2008, 2007. - 768 с. : ил.

2. Биохимия с упражнениями и задачами : учеб. для вузов / ред. Е. С. Северин. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 384 с. : ил.

3. Березов Т.Т. Биологическая химия : учебник / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. - 3-е изд., стереотип. – М.: Медицина, 2008. - 704 с. : ил.

4. Николаев А.Я. Биологическая химия : учебник / А. Я. Николаев. - 3-е изд, перераб. и доп. - М. : Мед. информ. агентство, 2007. - 568 с.

5. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии: Учеб. пособие для вузов / Зубаиров, Д. М., Тимербаев В.Н., Давыдов В.С. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2005.

6. Тапбергенов С.О. Медицинская биохимия.- Астана, 2001.

7. Шарманов Т.Ш., Плешкова С.М. Метаболические основы питания с курсом общей биохимии – Алматы, 1998

Контроль: качество выполнения методов исследования, оценка практических навыков работы на приборах

Оборудование и оснащение:

Оборудование: ФЭК АР – 101, ФЭК - 02, термостат ТСО 1/80, водяная баня, мойка ультразвуковая, рН-метр 150м, рН-метр С830Р, спектрофотометр, полуавтоматический/автоматический биохимический анализатор, весы лабораторные SPU 401,торсионные и аналитические весы, центрифуги, дистиллятор АДЭ – 5, компьютеры.

Оснащение: наборы химических реактивов для определения холестерина и ТАГ, реактивы для определения пре – бета липопротеинов и кетоновых тел, лабораторная химическая посуда, штативы, компьютерные анимации, тестовые задания, ситуационные задачи.