Количественное определение активности амилазы мочи

Мотивация. Количественное определение активности амилазы мочи является примером энзимодиагностики.

Реактивы. 0,1% раствор крахмала; 0,1% раствор Люголя.

Принцип. Амилаза осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы.

В качестве критерия активности амилазы в работе используется убывание исходного субстрата (крахмала) за определенное время. Определение активности амилазы основано на нахождении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают с йодом гамму цветов от фиолетового до оранжевого. Показателем полного расщепления крахмала является желтое окрашивание.

Амилазная активность выражается количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщеплять 1 мл неразведенной мочи при определенных условиях. В норме амилазная активность мочи равна 4 – 64 единицам. Резкое повышения амилазной активности мочи наблюдается при острых панкреатитах.

Ход работы.

1. Приготовление различных разведений мочи. В 8 пронумерованных пробирок наливают из бюретки по 1 мл дистиллированной воды. После этого в первую пробирку вносят 1 мл исследуемой мочи, тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Затем содержимое второй пробирки тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят в третью пробирку и т.д. до восьмой пробирки, из которой после перемешивания 1 мл смеси выливают. Таким образом, разведение мочи в указанных восьми пробирках составляет:

1

2ⁿ = -----------------

2 ^-n

где n – номер соответствующей пробирки.

2. Во все пробирки, начиная с восьмой, из бюретки наливают по 1 мл 0,1% раствора крахмала.

3. Все пробирки в штативе помещают в водяную баню (45^о С) на 15 минут.

4. После инкубации все пробирки охлаждают и в каждую из них добавляют по 1 капле раствора Люголя и тщательно перемешивают.

5. Результаты работы заносят в таблицу.

№ пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8
Разведение мочи	1/2	1/4	1/8	1/16	1/32	1/64	1/128	1/256
Окраска жидкости в пробирках после добавления раствора Люголя

1. Расчет активности амилазы мочи.

Активность амилазы мочи является величиной, обратной разведению слюны:

1 ^-х

А = --------------------- 2 ⁿ ед.

2 ^-n

где n – номер последней пробирки, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание).

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

Мотивация. Количественное определение активности амилазы слюны является примером энзимодиагностики.

Реактивы. 0,1% раствор крахмала; 0,1 % раствор Люголя.

Принцип. Амилаза слюны осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы, которая затем под влиянием содержащейся в слюне мальтазы, расщепляется на 2 молекулы глюкозы.

В качестве критерия активности амилазы в работе используется убывание исходного субстрата (крахмала) за определенное время. Определение активности амилазы основано на нахождении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала. Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают с йодом гамму цветов от фиолетового до оранжевого. Показателем полного расщепления крахмала является желтое окрашивание.

Амилазная активность слюны, или амилокластическая сила слюны, выражается количеством миллилитров 0,1% раствора крахмала, которое может расщеплять 1 мл неразведенной слюны при определенных условиях. В норме амилазная активность слюны равна 320-640 единицам.

Ход работы.

1. Приготовление рабочего раствора слюны. К 1 мл слюны добавляют 9 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают. Разведение слюны составляет: 10^-1 = 1/10

2. Приготовление различных разведений слюны. В 10 пронумерованных пробирок наливают из бюретки по 1 мл дистиллированной воды. После этого в первую пробирку вносят 1 мл рабочего раствора слюны, тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят во вторую пробирку. Затем содержимое второй пробирки тщательно перемешивают и 1 мл смеси переносят в третью пробирку и т.д. до десятой пробирки, из которой после перемешивания 1 мл смеси выливают. Таким образом, разведение слюны в указанных десяти пробирках составляет:

10 ^-1 . 2^-n = 1/10 . 2ⁿ

где n – номер соответствующей пробирки.

3. Во все пробирки, начиная с десятой, из бюретки наливают по 1 мл 0,1% раствора крахмала.

4. Все пробирки в штативе помещают в водяную баню (45^оС) на 20 минут.

5. После инкубации все пробирки охлаждают и в каждую из них добавляют по 1 капле раствора Люголя и тщательно перемешивают.

6. Результаты работы заносят в таблицу.

№ пробирки	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Разведение слюны	1/20	1/40	1/80	1/160	1/320	1/640	1/1280	1/2500	1/5120	1/10240
Окраска жидкости после добавления р-ра Люголя									синяя	синяя

2. Расчет активности амилазы слюны.

Активность амилазы слюны является величиной, обратной разведению слюны:

1

А= ----------------------------------- =10 ^. 2ⁿ ед.

10^{-1 .} 2^-n

где n – номер последней пробирки, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание).

ЗАВИСИМОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ОТ рН СРЕДЫ

Мотивация. Работа позволяет получить экспериментальные доказательства отдельных механизмов регуляции ферментативных реакций.

Реактивы. 10% раствор соляной кислоты; 10% раствор едкого натрия; 1% раствор крахмала; раствор Люголя.

Принцип. Каждый фермент обладает рН-оптимумом - значением рН, при котором он наиболее активен. В основе зависимости активности ферментов от рН среды лежит их белковая природа. Изменение степени ионизации ионогенных групп (прежде всего ионогенных групп активного центра) в зависимости от рН среды приводит к изменению конформации активного центра, следствием чего является изменение активности фермента.

Данная работа основана на сравнении активности амилазы слюны при различных значениях рН. В качестве критерия активности амилазы используется убывание исходного субстрата (крахмала) за определенное время.

Ход работы.

1. Приготовление рабочего раствора слюны. К 1 мл слюны добавляют 9 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают.

2. В три пронумерованные пробирки наливают по 10 капель рабочего раствора слюны (1:10), содержащего амилазу.

3. Во вторую пробирку вносят 1 каплю раствора соляной кислоты, а в третью - 1 каплю раствора едкого натра.

4. Во все пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала и тщательно встряхивают.

5. После 5-минутной инкубации в водяной бане (45^оС) во все пробирки добавляют по 3 капли раствора Люголя. Содержимое первой пробирки окрашивается в желтый цвет, во второй и третьей пробирках — в синий цвет.

Схемы выполнения работы

Реактивы	1-я пробирка	2-пробирка	3-я пробирка
Рабочий раствор слюны	10 капель	10 капель	10 капель
	-	1 капля	-
Раствор NaOH	-	-	1 капля
1% раствор крахмала	10 капель	10 капель	10 капель

Содержимое пробирок перемешивают и пробирки помещают в водяную баню (45^оС) на 5 минут.

Раствор Люголя

3 капли

3 капли

3 капли

6. Результаты работы занести в таблицу и сделать соответствующие выводы.

№№	Субстрат	Фермент	рН среды	Изменение окраски после добавления раствора Люголя
1.
2.

Выводы.

ЗАВИСИМОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫ

Мотивация. Работа позволяет получить экспериментальные доказательства отдельных механизмов регуляции ферментативных реакций.

Реактивы. 1% раствор крахмала; раствор Люголя.

Принцип. Каждый фермент обладает температурным оптимумом — температурой, при которой он наиболее активен. Чаще всего температурный оптимум находится в диапазоне 37—40°С.

При высоких температурах происходит необратимая инактивация вследствие тепловой денатурации. Чувствительность к высокой температуре называется термолабильностью ферментов.

При низких температурах (0°С) активность ферментов резко снижается, однако это ингибирование носит обратимый характер — при температурном оптимуме активность этих ферментов полностью восстанавливается.

Данная работа основана на сравнении активности амилазы слюны при различных температурах. В качестве критерия активности амилазы используется убывание исходного субстрата (крахмала) за определенное время.

Ход работы.

1. Приготовление рабочего раствора слюны. 1 мл слюны прибавляют к 9 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают.

2. В четыре пронумерованные пробирки помещают по 10 капель разведенной слюны.

1. Третью и четвертую пробирки помещают на лед.

3. Содержимое второй пробирки кипятят в течение 5 мин., а затем охлаждают до комнатной температуры.

4. Во все четыре пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала и тщательно встряхивают.

5. Третью и четвертую пробирки вновь помещают на лёд, а первую и вторую пробирки помещают на 5 минут в водяную баню (45°С).

2. В первую, вторую и третью пробирки добавляют по 1 капле раствора Люголя и тщательно перемешивают.

3. Четвертую пробирку помещают на 5 минут в водяную баню (45^оС), посте этого в нее добавляют 1 каплю раствора Люголя и тщательно перемешивают.

СХЕМА ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Реактивы	1-я пробирка	2-пробирка		3-я пробирка	4-я пробирка
Рабочий р-р слюны	10 капель	10 капель		10 капель	10 капель
		помещают в кипящую баню на 5 минут		Помещают в ледяную баню
1% р-р крахмала	10 капель	10 капель		10 капель		10 капель
	помещают в водяную баню при 45оС на 5 минут			помещают в ледяную баню на 10 минут
Раствор Люголя	1 капля		1 капля	1 капля		-
						помещают в водяную баню при 45оС на 5 минут
Раствор Люголя						1 капля

9. Результаты работы занести в таблицу и сделать соответствующие выводы.

№№	Субстрат	Фермент	Температурное воздействие	Изменение окраски после добавления раствора Люголя
1.
2.

Выводы.

Занятие 2

Тема: Лабораторный практикум: «Витамины»

Цель: продемонстрировать клинико-диагностическую значимость количественного определения витаминов в биологических жидкостях

Задачи обучения:

• обучить методам определения витаминов

Основные вопросы темы:

1. Методика определения Витамина В₁ (тиамина)

2. Методика определения Витамина В₆ (пиридоксина)

3. Методика определения Витамина С (аскорбиновой кислоты)

4. Оформление протоколов исследования

5. Обсуждение полученных результатов

Методы обучения и преподавания: проведение биохимических методик, оформление протоколов, обсуждение полученных результатов (TBL)

Литература

1. Биохимия : Учебник для мед. вузов / под ред. Е.С. Северина. - 5-е изд., испр. и доп., 4-е изд. - М. : ГЭОТАР-МЕД, 2009,2008, 2007. - 768 с. : ил.

2. Биохимия с упражнениями и задачами : учеб. для вузов / ред. Е. С. Северин. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 384 с. : ил.

3. Березов Т.Т. Биологическая химия : учебник / Т. Т. Березов, Б. Ф. Коровкин. - 3-е изд., стереотип. . - М. : Медицина, 2008. - 704 с. : ил.

4. Николаев А.Я. Биологическая химия : учебник / А. Я. Николаев. - 3-е изд, перераб. и доп. - М. : Мед. информ. агентство, 2007. - 568 с.

5. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии : Учеб. пособие для вузов / Зубаиров, Д. М., Тимербаев В.Н., Давыдов В.С. - М. : ГЭОТАР-Медиа, 2005.

6. Тапбергенов С.О. Медицинская биохимия.- Астана, 2001.

7. Шарманов Т.Ш., Плешкова С.М. Метаболические основы питания с курсом общей биохимии – Алматы, 1998

Контроль: качество выполнения методов исследования, оценка практических навыков работы на приборах

Оборудование и оснащение:

Оборудование: ФЭК АР – 101, ФЭК - 02, термостат ТСО 1/80, водяная баня, мойка ультразвуковая, рН-метр 150м, рН-метр С830Р, спектрофотометр, полуавтоматический/автоматический биохимический анализатор, весы лабораторные SPU 401,торсионные и аналитические весы, центрифуги, дистиллятор АДЭ – 5, компьютеры.

Оснащение: наборы химических реактивов для определения витаминов В₁, В₆ и вистамина С, лабораторная химическая посуда, штативы, компьютерные анимации, тестовые задания, ситуационные задачи.

Реакция на витамин В₁ (тиамин)

Принцип. Тиамин в щелочной среде с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета. Ход работы. В пробирку наливают около 1 мл диазореактива, 4—5 капель 5% раствора тиамина и около 1 мл 10% раствора соды. Появляетсй желтая окраска, переходящая в оранжевую.

Реакция на витамин В₂ (рибофлавин).

Принцип. Водород, образующийся при добавлении металлического цинка к концентрированной соляной кислоте, восстанавливает рибофлавин через промежуточное соединение красного цвета (родофлавин) в бесцветный лейкофлавин.

Ход работы. В пробирку к 10 каплям взвеси рибофлавина в воде (0:0,25%) добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и небольшое количество порошка металлического цинка (цинковая пыль). Выделяющийся водород реагирует с рибофлавином и раствор изменяет окраску из желтой в красную и розовую, а затем обесцвечивается.

Реакция на витамин B₆ (пиридоксин).

Принцип. Бесцветный раствор витамина B₆ приобретает красную окраску в присутствии хлорного железа; реакция обусловлена образованием комплексной соли типа фенолята железа красного цвета.

Ход работы. В пробирку к 5 каплям 5% раствора пиридоксина добавляют 1 каплю 5% раствора хлорного железа. После встряхивания смесь окрашивается в красный цвет.

Реакция на витамин РР (никотиновую кислоту).

Принцип. Никотиновая кислота при нагревании с раствором уксуснокислой меди образует синий осадок плохо растворимой медной соли.

Ход работы. В пробирку к 10 каплям 10% раствора уксусной кислоты прибавляют 5 мг никотиновой кислоты. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем 5% раствора уксуснокислой меди. Жидкость окрашивается в голубой цвет, а при стоянии выпадет в синий осадок водной соли никотиновой кислоты.

Реакция на витамин С (аскорбиновая кислота).

Принцип. Реакция обусловлена окислением аскорбиновой кислоты и восстановлением железосинеродистого калия в железистосинеродистый калий, последний с хлорным железом образует берлинскую лазурь.

Ход работы. В пробирке смешивают 1 каплю 5 % раствора железосинеродистого калия, 1 каплю 1% раствора хлорного железа и 5 капель 1 % вытяжки томатного сока. Жидкость приобретает зеленовато-синюю окраску и выпадает синий осадок берлинской лазури.