Субстратная специфичность ферментов

Мотивация. Работа «Субстратная специфичность ферментов» доказывает наличие абсолютной субстратной специфичности сахаразы и амилазы.

Реактивы. 0,1% раствор крахмала; реактив Фелинга.

Принцип. Субстратная специфичность ферментов — это способность ферментов воздействовать на один определенный субстрат или группу сходных субстратов, обладающих определенным типом связи. Амилаза слюны осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы, которая затем под влиянием содержащейся в слюне мальтазы расщепляется на 2 молекулы глюкозы.

Н₂О амилаза слюны

крахмал --------------------------------------------------> декстрины + мальтоза

Н₂О мальтаза слюны

мальтоза -------------------------------------------------> глюкоза

Сахараза расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу.

Н₂О сахараза

сахароза ----------------------------------------------> глюкоза + фруктоза

Данная работа основана на сравнительном изучении гидролиза амилазы слюны и дрожжевой

сахаразы различных субстратов – крахмала и сахарозы, содержащих соответственно 1-4 и 1-2-гликозидные связи. В качестве критерия активности исследуемых ферментов в работе используется появление продуктов катализируемых реакций, которые оценивают по реакции с Фелинговой жидкостью на восстанавливающие сахара.

Глюкоза, мальтоза и фруктоза, обладая свободной альдегидной или кетонной группой, дают положительную пробу Фелинга. С крахмалом и сахарозой, не обладающими восстанавливающей способностью, проба Фелинга отрицательна.

Ход работы.

1. Пронумеровать 4 пробирки.

2. В первую и вторую пробирки наливают 10 капель 0,1% раствора крахмала.

3. В третью и четвертую пробирки наливают 10 капель раствора сахарозы.

4. В первую и третью пробирки добавляют по 5 капель рабочего раствора слюны (1:10), содержащего амилазу, а во вторую и четвертую пробирки – по 5 капель раствора сахаразы.

5. Содержимое всех пробирок хорошо перемешивают и пробирки помещают в водяную баню (45^о С) на 5 минут.

6. После инкубации проводят пробу Фелинга: во все пробирки добавляют по 10 капель реактива Фелинга, хорошо перемешивают и помещают в кипящую баню на 1 минуту. Наблюдают появление красно-желтой окраски в первой и четвертой пробирках.

СХЕМА ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

Реактивы	1-я пробирка	2-я пробирка	3-я пробирка	4-я пробирка
0,1% раствор крахмала	10 капель	10 капель	-	-
1% раствор сахарозы	-	-	10 капель	10 капель
Рабочий раствор	5 капель	-	5 капель	-
Раствор сахаразы	-	5 капель	-	5 капель

Содержимое перемешивают и пробирки помещают в водяную баню (45^о С) на 5 минут.

Реактивы	1-я пробирка	2-я пробирка	3-я пробирка	4-я пробирка
Реактив Фелинга	10 капель	10 капель	10 капель	10 капель

Содержимое перемешивают и пробирки помещают в кипящую водяную баню на 1 минуту.

7. Результаты работы занести в таблицу и сделать соответствующие выводы.

№№	Субстрат	Фермент	Проба Фелинга
1.

Выводы.