3. Результаты и обсуждения

В ходе работы ген Tth-полимеразы был разрезан на две части по праймерам P1 и r2 (первая часть, рис. 1), и P2 и 12а (вторая часть). В данном отчете рассматривается первая часть.

Рисунок 1: Участок гена Tth-полимеразы обрезанный по праймерам P1 и r2.

Далее, была проведена ПЦР для увеличения концентрации исследуемого участка ДНК гена Tth-полимеразы. Электрофоретический анализ показал количество и размер амплифицированной ДНК (рис. 4)

1 2 3

500

750

1000

3000 2500 2000 1500

Рисунок 4: электрофоретический анализ препаративной ПЦР. 1 – пробирка №1; 2 – пробирка №2; 3 – маркер р250.

После чего была проведена рестрикция (рис. 5) плазмиды pET23a (рис. 2) и ампликона (рис. 1) по сайтам рестрикции FauND I и BamH I Рисунок 2: плазмида pET23a

Далее было проведено лигирование вставки в вектор. Получили плазмиду со встроенным участком

Рисунок 3: Плазмида pET23a со вставкой.

1 2 3 4 5

500

750

1000

3000 2500 2000 1500

Рисунок 5: Электрофоретический анализ рестрикции по сайтам FauND I и BamH I

1,2 – плазмида pET23a пробирки 1 и 2; 3,4 – участок гена Tth полимеразы; 5 – p250.

После чего была проведена трансформация компетентных клеток штамма Escherichia coli XL-Gold плазмидой со встроенным в нее участком Tth полимеразы. Трансформированные клетки были высеяны на питательную среду LB с ампициллином. Методом скрининга были определены колонии содержащие плазмиду с необходимой вставкой (рис. 6 и 7). Для проведения ПЦР использовались праймеры pET U и pET R.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 p250

250

500

750

3000 2500 2000 1500

1000

Рисунок 6: электрофоретический анализ скрининга колоний 1-12;

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 p250

250

500

750

1000

3000 2500 2000 1500

Рисунок 7: электрофоретический анализ скрининга колонии 13-24;

Исходя из результатов проведенного электрофоретического анализа, были взяты колонии 5,12,16,17 и 23, так как длина исследуемого фрагмента 1893 bp. Далее из выбранных колоний была выделена плазмидная ДНК методом щелочного лизиса. После чего был проведен рестрикционный анализ (рис. 8 и 9) выделенной ДНК эндонуклеазами рестрикции Sfr274 и Pst I (рис. 3).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 p250

500

750

1000

3000 2500 2000 1500

Рисунок 8: рестрикция плазмид со вставкой эндонуклеазами Sfr274 I и Pst I; 1 – клон №5 Sfr274 I, 2 – клон №5 Pst I, 3 – клон №12 Sfr274 I, 4 – клон №12 Pst I, 5 – клон №16 Sfr274 I, 6 – клон №16 Pst I, 7 – клон №17 Sfr274 I, 8 – клон №17 Pst I, 9 – клон №123 Sfr274 I, 10 – клон №23 Pst I;

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 p250

500

750

1000

3000 2500 2000

1500

Рисунок 9: рестрикция плазмид со вставкой эндонуклеазами Sfr274 I и Pst I; 1 – клон №5 Sfr274 I, 2 – клон №5 Pst I, 3 – клон №12 Sfr274 I, 4 – клон №12 Pst I, 5 – клон №16 Sfr274 I, 6 – клон №16 Pst I, 7 – клон №17 Sfr274 I, 8 – клон №17 Pst I, 9 – клон №123 Sfr274 I, 10 – клон №23 Pst I;

К сожалению, качество изображений не позволяет точно оценить размеры рестрикционных фрагментов, поэтому были проведены еще несколько рестрикций для точного подтверждения длин фрагментов (рисунки не приводятся). В результате были выбраны клоны 5, 16 и 23.

для Sfr274 I – 3925, 705, 414, 225, 150,

для Pst I – 3273, 1383, 763.

Для определения нуклеотидной последовательности необходимо было провести автосеквенирование интересующего участка. Для этого провели ПЦР с праймерами pET u и pET R. Далее провели рестрикцию эндонуклеазой Sfr274 I, с последующим электрофоретическим анализом в акриламидном геле, который подтвердил, что ПЦР прошла успешно, и вставка наработалась в достаточном количестве (рис. 10), так как длины фрагментов совпадают с теоретическими длинами, полученными в Vector NTI: 705, 414, 402, 225, 150, 68.

1 2 3 4

57

67

110

147

157

190

242

328

489

710

Рисунок 10: электрофоретический анализ участка гена Tth полимеразы после скрининга и рестрикции эндонуклеазой Sfr274 I в акриламидном геле; 1 – клон № 5, 2 – клон №16, 3 – клон № 23, 4 – «pBluScript/MspI».

Результат секвенирования не позволяет точно определить – отличаются ли полученные участки гена Tth полимеразы от найденного в базе данных NSBI генома Tth.

Для определения размера белка синтезируемого со вставки, провели индукцию его синтеза. Для индукции брали клетки штамма Escherichia coli BL-21 plyss, так как только ген РНК- полимеразы фага Т7, который встроен в ДНК этого штамма, может обеспечивать транскрипцию, в исследуемом участке и в плазмиде такого гена нет. Электрофоретический анализ в акриламидном геле (рис. 11) показал, что белок не индуцировался, т.е. не образовалось участка в 67 kDa и индуцированные образцы идентичны не индуцированному контролю.

1 2 3 4 5 6

489

710

57

67

110

147

157

190

242

Рисунок 11: электрофоретический анализ в акриламидном геле индукции синтеза белка участка гена Tth полимеразы; 1 – сывороточный альбумин, как контроль проведения электрофореза, 2 – клон №5, 3 – клон № 16, 4 – клон № 23, 5 – контроль клон № 16, 6 - «pBluScript/MspI».