Выделение плазмидной днк методом щелочного лизиса.
Для выращивания ночной культуры бактериальную колонию помещают в пробирку с 3 мл среды LB и ампициллином (100 мкг/мл), инкубируют в течение 12 часов при температуре 37°С и интенсивном встряхивании для эффективной аэрации. Далее суспензию центрифугируют 5 минут на 5000 rpm, отбирают супернатант и добавляют 300 мкл раствора 1, после чего ресуспендируют клетки и добавляют раствор 2. Полученную смесь осторожно перемешивают не дольше 3 минут, после чего добавляют раствор 3 для нейтрализации щелочи, осторожно перемешивают и добавляют 50 мкл хлороформа и каплю РНКазы. Далее инкубируют на льду 20-30 минут. После этого центрифугируют 15 минут на максимальных rpm и отбирают супернатант в чистую пробирку. К полученному раствору добавляют 0,8V изопропанола и инкубируют при 4оС на 20 минут. После чего центрифугируют 15 минут на максимальных rpm и отмывают 2 раза 75% этиловым спиртом. Осушают на 37оС и растворяют ДНК в 50 мкл TrisHCl 8,0(10мМ).
Индукция синтеза рекомбинантного белка.
Клетки E.coli, с трансформированной в них плазмидой, засевают в 1,5 мл LB среду с ампициллином (100 мкг/мл) и инкубируют при 37°С и интенсивном встряхивании до достижения культурой оптической плотности 0,6 – 1. Далее добавляют 1 мкл IPTG и инкубируют при 37оС и интенсивном перемешивании 3-4 часа. Полученную суспензию центрифугируют 5 минут на 5000 rpm, хранят полученный осадок при -20оС.
Автосеквенирование.
Перед секвенированием необходимо обессолить образцы ДНК для уменьшения ингибирующего влияния на полимеразу. Образцы ДНК около 40 мкл с концентрацией 0.1-2 мкг/мкл обессоливают на колонке Акрилекс П-6.
К акрилексу П-6 добавляют буфер (30 мМ KCl, 20 мМ TrisHCl, pH 7-8, 5 мМ ЭДТА). Буфера должно быть около 10 объёмов. Оставляют при комнатной температуре в течение 20 минут. Далее кипятят на водяной бане в течение 5 мин. (Хранится в холодильнике на +4).
В колонки на планшете добавляют сорбент и помещают в планшет для элюции, центрифугируют 30 сек.
Далее добавляют по 50 мкл воды в лунки с сорбентом, центрифугируют 30 сек. Процедуру повторяют 5 раз.
Планшет с колонками переносят в новый планшет для элюции ДНК.
На колонку наносят 40 мкл ДНК, центрифугируют 30 сек.
Секвенирующая реакция содержит общую смесь из расчёта на 1 образец ДНК:
BigDye 3.1 0.5 мкл
Буфер для BigDye 3 мкл
Праймер 10Х 2 мкл
Вода 6,5 мкл
ДНК 3 мкл.
Амплификацию проводят при следующих параметрах
96 – 30 сек
96 – 8 сек 6 циклов
60 – 3мин
96 – 8 сек
50 – 5 сек 20 циклов
60 – 3 мин
Далее ДНК переосаждают изопропиловым спиртом и отмывают этанолом.
Денатурирующий электрофорез белков в пааг.
Полученный при осаждении клеток осадок ресуспендировать в 50-300 мкл Tris-HCl pH 8,0. Для лизирования клеток добавляют к каждому образцу по 100 мкл воды и по 100 мкл буфера с меркаптоэтанолом и SDS. Далее ставят на водяную баню на 5 минут. Для разрушения геномной ДНК на образцы действуют ультразвуком.
Условия проведения электрофореза:
разделяющий гель (нижний): 10-15% ПААГ, 0.75 М TrisHCl pH 8.9 (3М 4х);
концентрирующий гель (верхний): 8-10% ПААГ, 0.075 М TrisHCl pH 6.7 (0.6М 8х);
верхний электродный буфер: 1х трис-глициновый буфер, 0.1% SDS;
нижний электродный буфер: 60 мМ TrisHCl pH 8.9.
Для приготовления 15 мл 12,5% разделяющего геля смешивают:
3,75 мл - 4 х TrisHCl pH8.9 (3 M)
6,25 мл - 30% акриламид
4,65 мл - воды
15 мкл - TEMED
200 мкл - 10% персульфат аммония.
Для приготовления 4 мл концентрирующего геля смешивают:
750 мл - 8 х TrisHCl pH6.7 (0.6 M)
1 мл - 30% акриламид
2,2 мл - воды
4 мкл - TEMED
40 мкл - 10% персульфат аммония.
Проводят электрофорез при напряженности электрического поля 15-20 В/см в течение 1,5-3 часов (пока краска не дойдет 1-2 см до нижнего края геля). После электрофореза гель красят около 12 часов в окрашивающем растворе. Далее краску отмывают промывочным буфером.