Электрофорез в агарозном геле.

Приготовление 1,3% агарозного геля:

К 100 мл буфера TAE (1x) необходимо добавить навеску 1,3 г агарозы и 5 мкл бромистого этидия. Получившуюся смесь нагревают до кипячения, затем заливают в форму и ставят гребенку для образования “карманов”. Застывший гель помещают в камеру для электрофореза, заполненную TAE буфером (1х). Далее исследуемая ДНК смешивается с краской для гель-электрофореза и наносится в карманы, так же в один из карманов наносится маркер молекулярного веса. Электрофорез проходит при напряжении в 240 B/см.

Экстракция днк смесью фенол-хлороформ.

На 200-300 мкл раствора ДНК добавляют по 0,5 V фенола в TE буфере и хлороформа. Полученный раствор перемешивается до состояния суспензии и центрифугируется 10 минут на 10000 rpm. Далее отбирается водная фаза и переносится в чистую пробирку.

Осаждение ДНК изопропанолом.

На 180 мкл раствора ДНК добавляют 0,15V NH₄Ac 2M, 1V 50% изопропанола и 5 мкл ЛПАА. Затем инкубируют на -20^оС в течении 30 минут. После этого центрифугируют 15 мин на максимальной скорости. Далее отбирают супернатант и промывают 180 мкл 75% этилового спирта. После чего остатки спирта осушают инкубированием при 37^оС 10-15 минут. В конце ДНК поднимают в 60мкл 10 мМ Tris HCl pH 8,0 посредством перемешивания в шейкере.

Гидролиз днк эндонуклеазами рестрикции.

Гидролиз ДНК проводят последовательно в 1х рестрикционных буферах, в которых оптимальна активность одной из рестриктаз с экстракцией ДНК смесью фенол-хлороформ и осаждением изопропанолом при смене буфера либо одновременно в одном 1х ресрикционном буфере, если активность обеих рестриктаз в нем оптимальна. В реакционную смесь добавляется 20 ед. акт. фермента на 1 мкг ДНК (1 мкл), примерно 1 мкг ДНК (4-5 мкл), 5 мкл 10х буфера и доводят до 50 мкл водой. Полученную смесь инкубируют в течение 2 часов при оптимальной для эндонуклеаз рестрикции температуре (37°С). Затем проводят экстракцию ДНК, смесью фенол-хлороформ, и осаждение изопропанолом для удаления рестриктаз и компонентов буфера.

Лигирование фрагментов днк.

В пробирке смешивают 2 мкл 10х лигазного буфера, прошедшие рестрикцию вектор и фрагмент в молярном соотношении 1:2-5 (переведенном в соотношение объемов растворов с учетом оцененной по гель-электрофорезу концентрации), 1 ед. акт. ДНК-лигазы фага Т4, воду до 20 мкл. Полученную лигазную смесь инкубируют при температуре 4°С в течение 3-6 часов.

Трансформация клеток e.Coli. Трансформация посредством метода “Heat shock”:

К 10 мкл ДНК (лигазная смесь) добавляют 50-200 мкл компетентных клеток E.Coli, затем перемешивают и оставляют на льду на 30 минут (вышеперечисленные действия проводятся по возможности в холоде). Далее клетки инкубируют 5 минут на 37^оС. Проводимость клеточной стенки увеличивается и плазмиды попадают внутрь клеток. После этого добавляют 1мл LB и ставят инкубироваться 30-60 минут на 37^оС, для восстановления клеточной стенки бактерий. Затем центрифугируют 5 минут на 5000 rpm, удаляют большую часть супернатанта и ресуспензируют осадок в остатках раствора(~50 мкл).

Скрининг бактериальных колоний с использованием метода пцр.

Колонии переносят в пробирку с 20 мкл дистиллированной воды и ресуспендируют. Проводят ПЦР, используя полученную клеточную суспензию в качестве матрицы, по 5 мкл на одну реакционную смесь, и подходящие праймеры. Объем одной реакционной смеси – 15 мкл. В качестве контроля используют плазмиду без встройки. Продукты ПЦР анализируют с помощью электрофореза в агарозном геле.