2.Материалы и методы.

1. Материалы

Бактериальные штаммы: Escherichia coli XL-Gold, Escherichia coli BL-21 plyss.

Геномная ДНК бактерии Thermus thermophilus.

Праймеры:

pET U (Primer 1): 5^’- ATAGGGAGACCACAACGGTT - 3^’

pET R (Primer 2): 5^’- AGCCAACTCAGCTTCCTTTC - 3^’

P1: 5’-TGAACATATGGAGGCGATGCTTCCGCTC-3’

r2: 5’- GCTATAGTCCAGGGCCACCAAC-3’

Плазмида pET23a

Реактивы

dNTP 10х (2мМ);

Агароза-“Chemapol”;

Бромистый этидий (10 мг/мл) ;

Фенол, уравновешанный ТЕ рН 9;

Хлороформ-изоамиловый спирт – 49:1;

NH₄Ac 2М;

Линейный полиакриламид (ЛПАА) 1х (0,5%);

Изопропанол;

EtOH 75%;

BSA 50х (10 мг/мл);

Ампициллин (50 мг/мл);

Раствор 1 (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 20 мМ ЭДТА);

Раствор 2 (200 мМ NaOH, 1% SDS);

Раствор 3 (3М KAc, pH 5,2);

IPTG 1М;

Tris-HCl 3М, pH 8,0;

Tris-HCl 0,6М, pH 6,7;

Акриламид (АА) 30%;

Персульфат аммония (ПСА) 10%;

TEMED

Красящий раствор BB G250 (G250 0,12%, H₃PO_4(конц) 10%, Am₂SO₄ 10%, EtOH 20%, H₂O_дист. до 300 мл);

Буферные растворы

ТАЕх50 (242г Tris-HCl, pH=8.0; 57,1г ледяной уксусной кислоты; 100 мл 0.5 М EDTA, рН=8.0);

ТЕ (Tris-HCl 10 мМ, pH 7,6, 1 мМ EDTA);

Лигазный буфер(30 мМ Tris-HCl pH 7,6, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ DTT, 0,5 мМ ATP);

Стандартные буферы для эндонуклеаз рестрикции:

Green (10 мМ Tris-HCl, pH=7.6, 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 1мМ DTT),

Yellow (33 мМ Tris-HCl, pH=7.9, 10 мМ MgAc₂, 66 мМ KAc, 1мМ DTT),

Blue (10 мМ Tris-HCl, pH=7.6, 10 мМ MgCl₂, 1мМ DTT),

Orange (50 мМ Tris-HCl, pH 7.6, 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT)

Промывочный буфер (55% этанол, 10 мМ Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl);

Буфер для нанесения на электрофорез в агарозном геле (0,5% бромфеноловый синий, 0,5% ксиленцианол FF, 50% глицерин в воде, SDS, меркаптоэтанол);

Буфер 2х для нанесения на электрофорез в ПААГ (100 мМ Tris-HCl pH=7,4, 1М β-меркапто-этанол, 2% SDS, 20% глицерол, бромфеноловый синий);

Верхний электродный буфер: трис-глициновый буфер, 0,1% SDS;

Нижний электродный буфер: 60 мМ TrisHCl pH 8.9.

Ферменты

ДНК-лигаза фага Т4 (1000 ед.акт./мкл);

РНКаза А (100 мкг/мл);

Эндонуклеазы рестрикции:

Pst I: 20000 u/ml;

Sfr274 I: 20000 u/ml;

FauND I: 10000 u/ml;

BamH: 20000 u/ml;

Taq-полимераза фага Т4 (250 ед.акт./мл);

Pfu-полимераза (200 ед.акт./мл).

Питательные среды

LB, на 100ml:

1 г NaCl,

1 г бактериального пептона,

0,5 г дрожжевого экстракта;

Агар, на 100ml:

1 г NaCl,

1,5 г бактериального агара,

1 г бактериального пептона,

0,5 г дрожжевого экстракта.

Маркеры молекулярного веса

«p250»: 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 (b.p).;

«pBluScript/MspI»: 710, 489, 404, 328, 242, 190, 157, 147, 110, 65, 57;

2. Методы Полимеразная цепная реакция (пцр).

Смесь для проведения ПЦР содержит:

Буфер 10х: 2,5 мкл;

dNTP 10х: 2,5 мкл разведенного до 0,2 мМ раствора;

Вода: 7,5 мкл;

Taq-полимераза фага Т4: 0,1 мкл;

Pfu-полимераза: 0,025 мкл;

Матрица ДНК: 2,5 мкл;

Смесь праймеров U и R x2,5: 10 мкл.

Для предотвращения испарения амплификационной смеси в пробирку добавляют пару капель минерального масла.

ПЦР проводилась на амплификаторе “Терцик” со следующими параметрами:

1. Первичная денатурация ДНК: 96^оС – 3 мин.;

2. Денатурация ДНК: 96^оС – 5 с;

3. Отжиг праймеров: 60^оС – 5 с; 37 циклов

4. Элонгация цепи: 72 – 1 мин.;