МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ФАКУЛЬТЕТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК

КАФЕДРА МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

Отчёт

По большому биохимическому практикуму:

Клонирование участка гена ДНК-полимеразы Thermus thermophilus

в плазмиду pET23a

Руководители: к.б.н. Боярских У.А., к.б.н. Храпов Е. А.

Выполнил: студент 4 курса 10411 гр. ФЕН НГУ Сухих И.С.

Новосибирск

2013 г.

Содержание

1. Введение. ……………………………………………………………………………………………………………………………. 3.

2. Материалы и методы. ………………………………………………………………………………………………………… 4.

   1. Материалы. …………………………………………………………………………………………………………….. 4.

   2. Методы. ………………………………………………………………………………………………………………….. 6.

3. Результаты и обсуждения. ………………………………………………………………………………………………….. 11.

4. Выводы. ……………………………………………………………………………………………………………………………….. 18.

1.Введение.

Tth-ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, состоящей из полипептида с молекулярной массой примерно 94 кДа. Источником этого фермента является бактерия Thermus thermophilus. Длина полипептидной цепи равна 834 аминокислотных остатка. Полимераза обладает 5’-3’-экзонуклеазной активностью (эта активность проявляется только при работе фермента на двухцепочечной ДНК) и не имеет 3’-5’-экзонуклеазной (корректирующей) активности. Наличие данной (какой?)активности делает фермент пригодным для использования его в RealTime PCR. Способность Tth полимеразы образовывать цепь ДНК на матрице РНК позволяет использовать этот фермент в реакциях синтеза кДНК.

Одним из замечательных свойств Tth-полимеразы, является способность фермента осуществлять синтез ДНК по цепи РНК в качестве матрицы. То есть, было обнаружено, что данная полимераза обладает обратно-транскриптазной (ревертазной) активностью. Это позволило использовать данный фермент в совмещенной реакции обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР). Раньше, синтезировать к-ДНК используя обратные транскриптазы было проблематично, из-за стабильной вторичной структуры РНК. Повышение температуры разрушало вторичную структуру, однако понижало эффективность обратных транскриптаз.

Чтобы увеличить эффективность реакции стали использовать термостабильную Taq-полимеразу. Появилась возможность получать полноразмерные фрагменты ДНК, и сразу амплифицировать их с помощью того же фермента. Позже обнаружилось, что Tth-полимераза в 100 раз более эффективна в реакции ОТ/ПЦР. Продукт в такой реакции может быть обнаружен, даже если он синтезирован со 100 копий синтетической кРНК (ссылка?).

Цель

Целью данной работы является получение участка гена Tth-полимеразы, ограниченного праймерами P1/R2, и встроенного в вектор (Клонирование 3’-концевого фрагмента гена Tth-полимеразы в бактериальный экспресионный вектор) , а так же индукция синтеза рекомбинантного белка.

Задачи

Для достижения этой цели необходимо:

1. Вырезать участок гена Tth-полимеразы посредством рестрикции, по праймерам P1/R2.

2. Всроить участок в плазмиду pET23a.

3. Наработать плазмиду со вставкой посредством трансформации ее в клетки E.Coli, с последующим высеванием их на питательную среду.

4. Проверить результаты с помощью рестрикций и гель-электрофореза.

5. Секвенировать встроенный участок гена Tth-полимеразы.

6. Провести индукцию синтеза рекомбинантного белка.

Амплифицировать 3’-концевой фрагмент гена Tth-полимеразы длиной