3.2 Морфология дрожжей

Дрожжи – это одноклеточные, неподвижные, бесцветные микроорганизмы, относящиеся к классу грибов, – аскомицеты. Большинство дрожжей утратило способность образовывать мицелий и существует в виде отдельных клеток (оидии).

Форма клеток дрожжей чаще округлая, овальная, яйцевидная, эллиптическая, реже – палочковидная, серповидная, лимонообразная и др.

Размеры дрожжевых клеток несколько больше бактериальных и достигают от 10 до 15 мкм по длине и 3-5 мкм в поперечнике. В клетке имеется оболочка, цитоплазма с включениями, ясно выраженное дифференцированное ядро, запасные питательные вещества – гликоген, капельки жира.

Морфологические свойства дрожжевой клетки имеют возрастные особенности: в старых клетках утолщается оболочка, увеличивается зернистость цитоплазмы, появляются вакуоли, крупные жировые включения, исчезает гликоген. Поэтому исследование морфологии дрожжей является одним из способов определения технологических свойств дрожжей – их функциональной активности и жизнеспособности. Основным способом размножения грибов является почкование. Оно выражается в том, что на дрожжевой клетке появляется бугорок – почка, увеличивающаяся в размерах. В нее переходит часть разделившегося ядра и содержимого цитоплазмы, после чего почка отшнуровывается от материнской клетки и начинает самостоятельное существование.

Многие дрожжи, называемые истинными, могут размножаться при помощи спор, которых обычно бывает от 2 до 12. Дрожжевая клетка рассматривается в этом случае как аска (сумка), а споры – как аскоспоры.

Дрожжи широко применяются в промышленности благодаря их способности сбраживать сахара с образованием этилового спирта и углекислого газа, некоторые вызывают порчу пищевых продуктов /1, 38 - 42/.

Изучение морфологии дрожжей проводят при микроскопии прижизненных как окрашенных, так и неокрашенных препаратов типа «раздавленная капля». Для этого каплю дрожжей наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, микроскопируют при средних и больших увеличениях в затемненном поле зрения, для чего сужают диафрагму или опускают конденсор.

Задание:

1) Рассмотреть рост мицелия гриба на питательном субстрате в чашке Петри. Увеличение объектива – малое (8^х). Зарисовать, условно обозначив поле зрения кругом. Отметить радиальное разрастание грибницы, концы гифов плесневых грибов, общее увеличение микроскопа.

2. Изучить типы строения мицелия гриба, приготовив прижизненный препарат типа «раздавленная капля» неокрашенный. Увеличение объектива вначале – малое (8^х), а затем – среднее (40^х). Зарисовать одноклеточный и многоклеточный мицелий.

3. Изучить способы бесполого спорообразования плесневых грибов на препарате «раздавленная капля». Увеличение объектива – малое (8^х) и среднее (40^х). Зарисовать спорангионосцы со спорангиями, различное строение конидиеносцев с конидиями.

4)Изучить морфологию дрожжей, приготовив препарат «раздавленная капля». Увеличение объектива вначале – среднее (40^х), а затем – большое (90^х). Зарисовать. Отметить форму дрожжевой клетки, найти почкующиеся клетки и клетки со спорами.

К о н т р о л ь н ы е в о п р о с ы:

1. Каковы особенности микроскопии плесневых грибов в сравнении с бактериями?

2. Как приготовить препарат из плесневых грибов для микроскопирования?

3. Как приготовить препарат из дрожжей для микроскопирования?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 4.

Культивирование микроорганизмов на питательных средах

Цель: Ознакомить студентов с основными, наиболее часто используемыми в производственных условиях питательными средами, способами их приготовления и принципами классификации; познакомить студентов с основными способами стерилизации, методами посевов и пересевов микроорганизмов, а также с условиями выращивания (культивирования) микроорганизмов на питательных средах.

М а т е р и а л ы и о б о р у д о в а н и е: автоклав, сушильный шкаф, аппарат Коха, фильтры Зейтца, прибор Арестовского, колбы, воронки, пробирки, химические стаканы, штативы для пробирок, аппарат для скашивания агара, сухой питательный агар, вата, марля, ножницы, бумага, нитки, спиртовки, среды в пробирках, скошенный агар, агар столбиком, мясо-пептонный бульон, стерильные чашки Петри, шпатель Дригальского, микробиологические петли и иглы.

Культивирование (выращивание) микроорганизмов широко применяется в лабораторных и производственных условиях для выделения, накопления и сохранения микроорганизмов. Этот метод применяется при качественном анализе микрофлоры различных объектов (сырья, полуфабрикатов, воздуха, воды, почвы и т.д.), для идентификации микроорганизмов и изучения их биологических свойств, при количественном анализе – для подсчета жизнеспособных особей, а в производственных условиях – для накопления полезных человеку микроорганизмов, продуктов их жизнедеятельности, а также для выявления посторонней микрофлоры.

Для культивирования микроорганизмов необходимы питательные среды, из которых микробы получают материал для строительных (питание) и энергетических (дыхание) функций клетки.

4.1 П и т а т е л ь н ы е с р е д ы

Среда, пригодная и применяемая для выращивания микроорганизмов, называется питательной средой. Питательные среды, используемые в микробиологической практике, должны отвечать следующим требованиям:

1. быть полноценными по своему составу, т.е. содержать все необходимые питательные вещества в легкоусвояемой форме (азотистые, углеводные, минеральные вещества, витамины) в необходимых концентрациях;

2. содержать достаточное количество воды (не менее 60%), которая является растворителем питательных веществ и дополнительным источником кислорода, водорода, некоторых минеральных элементов;

3)иметь строго определенную кислотность (рН) среды. Так, для выращивания большинства бактерий рН среды должна быть нейтральной или слабо-щелочной, колебаться в пределах 7,0-8,5, а для выращивания плесневых грибов и дрожжей – среда должна иметь кислую реакцию рН 4,5-6,5.

4. обязательно быть стерильными, поскольку посторонние микроорганизмы изменяют свойства среды и затрудняют культивирование и изучение определенных микробов.

Следует помнить, что универсальных, пригодных для всех видов микроорганизмов, питательных сред не существует. Отдельные виды микробов в зависимости от особенностей обменных процессов нуждаются в различных питательных веществах и условиях культивирования.

Все существующие в микробиологической практике питательные среды классифицируют по происхождению – на естественные и искусственные, по консистенции – на жидкие и плотные и по назначению – на стандартные, избирательные и дифференциально-диагностические.

Естественные (или натуральные) питательные среды состоят из натуральных пищевых продуктов (молока, яиц, картофеля, моркови, свеклы, капусты, фруктов, мяса). Искусственные среды готовят по специальным рецептам из пищевых продуктов, в которые после соответствующей обработки вводят дополнительные химические вещества. Разновидностью искусственных питательных сред являются синтетические среды. Их готовят из различных солей и сахаров, растворенных в дистиллированной воде.

Жидкие питательные среды имеют при комнатной температуре жидкую консистенцию. К ним относят мясо-пептонный бульон (МПБ), жидкое сусло (СЖ), желчный бульон, молоко, пептонную воду.

Плотные питательные среды получают путем уплотнения жидких сред. В качестве уплотнителей в микробиологической практике используют агар-агар и желатин. Агар-агар (по-малайски – желе) – плотный волокнистый материал, получаемый из морских водорослей и образующий в водных растворах плотный гель. Температура плавления агара-агара около 100 ^оС, а температура застывания 42-44^оС. Благодаря способности придавать питательному продукту консистенцию плотного студня и высокой устойчивости к ферментативному действию микробов агар-агар широко применяется при изготовлении плотных питательных сред; его добавляют к жидкой среде в концентрации 1,5-4%.

Желатин – белковое вещество животного происхождения. Его добавляют к жидкой питательной среде с целью уплотнения в концентрации 10-12%. Застывает желатиновый гель при 20^оС, разжижается при 22-27^оС. Применение его как уплотнителя сред ограничено, поскольку температура плавления желатинового геля ниже температуры выращивания большинства микроорганизмов (35-37^оС) и кроме того, он разжижается микроорганизмами, способными расщеплять белок.

Примерами плотных питательных сред являются мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный желатин (МПЖ), сусло-агар (СА), сусло-желатин (СЖ) и т.д.

Стандартные (общеупотребительные) питательные среды пригодны для развития многих видов микроорганизмов. Стандартными средами для выращивания бактерий являются мясные среды, приготовленные на основе мясо-пептонного бульона (МПБ) – МПА, МПЖ, стандартными средами для выращивания плесневых грибов, дрожжей служат сусловые среды – СА, СЖ.

Элективные (избирательные) питательные среды обеспечивают преимущественное накопление одного вида или группы микроорганизмов и совершенно непригодны для развития других. В микробиологии такие среды применяют преимущественно для выделения микроорганизмов из мест их естественного обитания, где имеется много посторонних микробов. Примерами элективных сред являются молочная сыворотка (для выращивания молочнокислых бактерий), среда Эндо, Кесслер (для кишечно-тифозной группы бактерий) и др.

Дифференциально-диагностические среды служат для дифференциации различных видов микроорганизмов на основании различий в обменных процессах. Такими средами пользуются в основном для идентификации неизвестных видов микроорганизмов. Примерами дифференциально-диагностических сред являются среда Гисса (для определения способности микробов расщеплять углеводы), кровяной агар (для выявления способности микроорганизмов расщеплять эритроциты крови) и др.

Рецептов приготовления питательных сред очень много. Наиболее часто в микробиологической практике употребляют МПБ, МПА, МПЖ приготовленные на основе мясной воды, и СА, СЖ, основой которым служит солодовое сусло, неохмеленное пивное сусло.

В настоящее время в микробиологической практике все большее применение находят сухие питательные среды – сухой питательный агар (СПА), среды для определения бактерий кишечной группы – Эндо, Плоскирева и др. Это гигроскопические порошки, содержащие все необходимые компоненты для развития микроорганизмов. Перед работой их растворяют в воде в концентрации от 1,5 до 6%, стерилизуют и используют для посева микроорганизмов.

Преимущество сухих сред заключается в простоте их приготовления, удобстве хранения и транспортировки, стандартности состава, что намного облегчает работу микробиолога.

4.2 М е т о д ы с т е р и л и з а ц и и

Стерилизация или обеспложивание (от лат. sterilis – бесплодный) – это процесс полного уничтожения вегетативных форм микроорганизмов и их спор с любых поверхностей. В микробиологической практике стерилизуют стеклянную посуду, питательные среды, инструменты и другие предметы лабораторного обихода.

Различают термическую стерилизацию, обусловленную воздействием на предметы высокой температуры, и холодную стерилизацию, осуществляемую при комнатной температуре (фильтрование, воздействие ультрафиолетовыми лучами, ультразвуком, обработка химическими веществами – антисептиками). В микробиологической практике наиболее часто используются приемы термической стерилизации: прокаливание в пламени спиртовки, стерилизацию сухим жаром, насыщенным паром под давлением, текучим паром и т.д.

Прокаливание в пламени (фламбирование). Этим методом стерилизуют бактериологические иглы, петли, шпатели, пипетки, предметные стекла, пинцеты, ножницы, прокаливая их перед использованием в пламени спиртовки. При этом микроорганизмы, как и все живое, сгорают под действием высокой температуры.

Стерилизация сухим жаром. Этот способ осуществляется в специальном сушильном шкафу при температуре 160-170⁰С в течение 1-2 часов. Действие сухого жара в отсутствие влаги заключается в обугливании микроорганизмов и их спор. Этим способом стерилизуют стеклянную посуду – чашки Петри, колбы, пробирки, пипетки. Перед стерилизацией пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, чашки Петри и пипетки плотно завертывают в бумагу во избежание попадания на них микроорганизмов из воздуха после окончания термообработки.

Стерилизация паром под давлением (автоклавирование). Это наиболее быстрый и надежный способ стерилизации питательных сред, посуды, халатов, осуществляемый в специальных герметически закрывающихся аппаратах – автоклавах. Сущность метода заключается в обработке материала паром под давлением выше атмосферного. При нормальном атмосферном давлении водяной пар имеет температуру 100⁰С. При увеличении же давления внутри сосуда с горячим водяным паром значительно повышается температура пара (табл. № 1), что ускоряет гибель микроорганизмов и их спор.

Таблица 1 - Режимы стерилизации

Избыточное давление, атм	tо насыщенного пара, оС	Продолжительность стерилизации, мин
0,5	112	30
1	121	20
1,5	128	10
2	134	10

Стерилизация текучим паром. Этот способ термической обработки проводится в аппарате Коха и используется для стерилизации питательных сред, изменяющих свойства при температуре выше 100^оС. При этом субстрат нагревают при 100 ^оС (температура кипения воды при нормальном давлении) в течение 1 час. Поскольку при таком режиме погибают только вегетативные формы, то прибегают к трехкратной или дробной стерилизации. При этом в интервале между стерилизациями питательные среды выдерживают в течение 24 часов в термостатах при температуре 28-37^оС для ускорения прорастания содержащихся в среде спор, а полученные вегетативные клетки уничтожаются при последующем нагревании при 100^оС.

Проводить дробную стерилизацию можно и в автоклаве с незавинченной крышкой, когда пар будет свободно выходить из аппарата наружу.

Стерилизация фильтрованием. Сущность метода заключается в пропускании (фильтровании) жидких питательных сред, растворов, изменяющих свои свойства даже при незначительном нагревании, через специальные мелкопористые фильтры, на которых задерживаются микроорганизмы. Чаще всего на практике применяют мембранные фильтры из коллодия, ацетата, целлюлозы, асбестовые фильтры Зейтца, «свечи» из каолина (свечи Шамберлана), инфузорной земли (свечи Беркефельда) и др.

Стерилизуемая жидкость наливается через стерильный фильтр в стерильный приемник, в котором с помощью насоса создается вакуум. Микроорганизмы оседают в порах фильтра благодаря как механической преграде, так и в результате электрической адсорбции (клетки в водной суспензии имеют отрицательный заряд, а фильтры изготовлены из положительно заряженных материалов).