№ 4 Значение открытия Д.И. Ивановского. Этапы развития вирусологии. Роль ученых в развитии вирусологии.
Впервые существование вируса доказал в 1892 году Ивановский. В результате наблюдений он высказал предположение, что болезнь табака, под названием мозаичной, представляет собой не одно, а два совершенно различных заболевания одного и того же растения: одно из них - рябуха, возбудителем которого является грибок, а другое неизвестного происхождения. Возбудитель мозаичной болезни табака не мог быть обнаружен в тканях больных растений с помощью микроскопа и не культивировался на искусственных питательных средах. Ивановский открыл вирусы - новую форму существования жизни. Своими исследованиями он заложил основы ряда научных направлений вирусологии: изучение природы вируса, цитопаталогических вирусных инфекций, фильтрующихся форм микроорганизмов, хронического и латентного вирусоносительства.
Этапы развития:
Конец XIX — начало XX-го века. Основным методом идентификации вирусов в этот период был метод фильтрации через бактериологические фильтры, которые использовались как средство разделения возбудителей на бактерии и небактерии. Были открыты следующие вирусы: вирус табачной мозаики; ящура; желтой лихорадки; оспы и трахомы; полиомиелита; кори; вирус герпеса.
30-е годы — основным вирусологическим методом, используемым для выделения вирусов и их дальнейшей идентификации, являются лабораторные животные. 1931 г. — в качестве экспериментальной модели для выделения вирусов стали использоваться куриные эмбрионы, которые обладают высокой чувствительностью к вирусам гриппа, оспы, лейкоза. Открыты: вирус гриппа; клещевого энцефалита.
40-е годы. Установили, что вирус осповакцины содержит ДНК, но не РНК. Стало очевидным, что вирусы отличаются от бактерий не только размерами и неспособностью расти без клеток, но и тем, что они содержат только один вид нуклеиновой кислоты — ДНК или РНК. Введение в вирусологию метода культуры клеток явилось важным событием, давшим возможность получения культуральных вакцин. Из широко применяемых в настоящее время культуральных живых и убитых вакцин, созданных на основе аттенуированных штаммов вирусов, следует отметить вакцины против полиомиелита, паротита, кори и краснухи.
50-е годы: Открыты вирусы: аденовирусы; краснухи; вирусы парагриппа.
70-е годы: открытие в составе РНК-содержащих онкогенных вирусов фермента обратной транскриптазы (ревертазы). Становится реальным изучение генома РНК содержащих вирусов. Открыты вирусы: вирус гепатита B; ротавирусы, вирус гепатита A.
80-е годы. Развитие представлений о том, что возникновение опухолей может быть связано с вирусами. Компоненты вирусов, ответственные за развитие опухолей, назвали онкогенами. Открыты вирусы: иммунодефицита человека; вирус гепатита C.
№5 Световой микроскоп, его устройство, разрешающая сила и работа с ним. Изучение микробов в световом, люминесцентном и др.микроскопах Невооруженным глазом человек может различить две очень близко лежащие линии или точки лишь в том случае, если расстояние между ними будет не менее 0,10 мм (100 мкм). Если же это расстояние будет меньше, то две линии или точки сольются в одну. Таким образом, разрешающая способность человеческого глаза равна 100 мкм. Поэтому, чем больше разрешающая способность объектива, тем больше подробностей строения наблюдаемого объекта можно выявить. Для объектива (х8) разрешающая способность равна 1,68 мкм, для объектива (х40) – 0,52 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм.
Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение. Различают полезное и бесполезное увеличения. Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения. Например, если изображение, полученное с помощью микроскопа (полезное!), увеличить еще во много раз, спроецировав его на экран, то новые, более тонкие детали строения при этом не выявятся, а лишь соответственно увеличатся размеры имеющихся структур.
Правила работы с микроскопом
1. Работать с микроскопом следует сидя;
2. Микроскоп осмотреть, вытереть от пыли мягкой салфеткой объективы, окуляр, зеркало или электроосветитель;
3. Микроскоп установить перед собой, немного слева на 2-3 см от края стола. Во время работы его не сдвигать;
4. Открыть полностью диафрагму, поднять конденсор в крайнее верхнее положение;
5. Работу с микроскопом всегда начинать с малого увеличения;
6. Опустить объектив 8 - в рабочее положение, т.е. на расстояние 1 см от предметного стекла;
7. Установить освещение в поле зрения микроскопа, используя электроосветитель или зеркало. Глядя одним глазом в окуляр и пользуясь зеркалом с вогнутой стороной, направить свет от окна в объектив, а затем максимально и равномерно осветить поле зрения. Если микроскоп снабжен осветителем, то подсоединить микроскоп к источнику питания, включить лампу и установить необходимую яркость горения;
8. Положить микропрепарат на предметный столик так, чтобы изучаемый объект находился под объективом. Глядя сбоку, опускать объектив при помощи макровинта до тех пор, пока расстояние между нижней линзой объектива и микропрепаратом не станет 4-5 мм;
9. Смотреть одним глазом в окуляр и вращать винт грубой наводки на себя, плавно поднимая объектив до положения, при котором хорошо будет видно изображение объекта. Нельзя смотреть в окуляр и опускать объектив. Фронтальная линза может раздавить покровное стекло, и на ней появятся царапины;
10. Передвигая препарат рукой, найти нужное место, расположить его в центре поля зрения микроскопа;
11. Если изображение не появилось, то надо повторить все операции пунктов 6, 7, 8, 9;
12. Для изучения объекта при большом увеличении, сначала нужно поставить выбранный участок в центр поля зрения микроскопа при малом увеличении. Затем поменять объектив на 40 х, поворачивая револьвер, так чтобы он занял рабочее положение. При помощи микрометренного винта добиться хорошего изображения объекта. На коробке микрометренного механизма имеются две риски, а на микрометренном винте - точка, которая должна все время находиться между рисками. Если она выходит за их пределы, ее необходимо возвратить в нормальное положение. При несоблюдении этого правила, микрометренный винт может перестать действовать;
13. По окончании работы с большим увеличением, установить малое увеличение, поднять объектив, снять с рабочего столика препарат, протереть чистой салфеткой все части микроскопа, накрыть его полиэтиленовым пакетом и поставить в шкаф.
Люминесцентная (или флюоресцентная) микроскопия. Основана на явлении фотолюминесценции.
Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта.
Темнопольная микроскопия. Микроскопия в темном поле зрения основана на явлении дифракции света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости мельчайших частиц (эффект Тиндаля). Эффект достигается с помощью параболоид- или кардиоидконденсора, которые заменяют обычный конденсор в биологическом микроскопе .
Фазово-контрастная микроскопия. Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, которая может быть позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объекта на темном фоне.
Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители.
Электронная микроскопия. Позволяет наблюдать объекты, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов
№6 Простые и сложные методы окраски микробов
Методы окраски. Окраску мазка производят простыми или сложными методами. Простые заключаются в окраске препарата одним красителем; сложные методы (по Граму, Цилю-Нильсену и др.) включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства. Существуют специальные методы окраски, которые используют для выявления жгутиков, клеточной стенки, нуклеоида и разных цитоплазматических включений.
При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, используя красители анилинового ряда (основные или кислые). Если красящий ион (хромофор) — катион, то краситель обладает основными свойствами, если хромофор - анион, то краситель имеет кислые свойства. Кислые красители — эритрозин, кислый фуксин, эозин. Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Из сухих красителей, продающихся в виде порошков, готовят насыщенные спиртовые растворы, а из них — водно-спиртовые, которые и служат для окрашивания микробных клеток. Микроорганизмы окрашивают, наливая краситель на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены.
Сложные методы окраски применяют для изучения структуры клетки и дифференциации микроорганизмов. Окрашенные мазки микроскопируют в иммерсионной системе. Последовательно нанести на препарат определенные красители, различающиеся по химическому составу и цвету, протравы, спирты, кислоту и др.
Существуют несколько основных окрасок: по Граму, по Цилю-Нильсену, по Ауески, Нейссера, Бури-Гинса.
Методика окраски по Граму.Особенностью окраски по Грамму является неодинаковое отношение различных микробов к красителям. Микробы, входящие в группу грамположительных, например стафилококки, стрептококки, дают прочное соединение с красителями и йодом. Окрашенные микробы не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, вследствие чего при дополнительной окраске фуксином грамположительные микробы не изменяют первоначально принятый фиолетовый цвет. Это объясняется строением клеточной стенки грамположительных бактерий. Основным компонентом толстой клеточной стенки этих бактерий является многослойный пептидогликан, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Грамотрицательные бактерии (гонококки, менингококки, возбудители кишечных заболеваний) образуют с генциановым фиололетовым и йодом легко разрушающееся под действием спирта соединение, в результате чего они обесцвечиваются и затем окрашиваются фуксином в красный цвет. Клеточная стенка таких бактерий представлена тонким слоем пептидогликана.
1. На фиксированный мазок наносят раствор генцианового фиолетового на 2мин.
2. Затем сливают краситель и, не промывая мазок, наливают раствор Люголя на 1мин.
3. Сливают раствор Люголя и наносят на 30сек 96 град спирт, пока не перестанет отходить краситель.
4. Мазок промывают дистиллированной водой и окрашивают в течении 2 мин раствором фуксина.
5. После чего сливают краситель, мазок промывают водой и высушивают. Грамположительные бактерии окрашиваются в синий (фиолетовый) цвет, а грамотрицательные бактерии – в красный.
Методика окраски по Бурри-Гинсу.Некоторые виды бактерий продуцируют слизистое вещество, которое концентрируясь вокруг тела микробной клетки, образует капсулу. Данная окраска служит для выявления у бактерий капсул.
1. На середину предметного стекла наносят капельку туши и смешивают ее петлей с каплей культуры.
2. Делают мазок ребром покровного стекла, дают высохнуть и фиксируют над пламенем горелки.
3. Затем промывают дистиллированной водой и красят 5-10 мин фуксином.
4. Затем вновь мазок промывают водой и высушивают. При микроскопии бактерии окрашиваются в красный цвет, фон черный, а капсулы неокрашенные.
Методика окраски по Ожешко.Этот метод служит для выявления у бактерий спор. Споры имеют вид круглых или овальной формы образований, находящихся в теле микробной клетки. Различают три вида расположения спор по отношению к длинной оси палочки: центральное – спора находится в центре тела микроба, субтерминальное – спора расположена ближе к одному из ее концов, терминальное – спора располагается на конце палочки.
1. На высушенный нефиксированный мазок наливают 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2мин над пламенем горелки до закипания.
2. Остывший препарат промывают водой, высушивают и фиксируют над пламенем спиртовки.
3. Затем на мазок наносят раствор фуксина Циля и нагревают над пламенем спиртовки до отхождения паров.
4. После того как препарат остынет, обесцвечивают его 5% раствором серной кислоты, промывают водой и докрашивают метиленовым синим в течении 3-5 мин, затем промывают водой и подсушивают. Споры, окрашенные фуксином имеют красный цвет, тело микробной клетки – синий цвет.
Методика окраски по Цилю-Нильсенудля кислотоустойчивых бактерий (возбудители туберкулеза и проказы). Особенностью микробов этой группы является то, что они плохо воспринимают окраску. Для того чтобы окрасить кислотоустойчивые микроорганизмы, приходится применять более концентрированные растворы красителя в подогретом состоянии с протравами и удлиненным сроком окраски.
1. Фиксированный над пламенем спиртовки мазок окрашивают в течение 3-5мин фуксином Циля с подогреванием до появления паров.
2. Дают препарату остыть, промывают водой.
3. Обесцвечивают в течение 3-5 с в 5% растворе серной кислоты.
4. Препарат промывают водой.
5. окрашивают метиленовым синим в течение 3-5 мин.
6. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют.
При окраске препаратов по методу Циля-Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в рубиново- красный цвет и не обесцвечиваются кислотой. Некислотоустойчивые бактерии, а также элементы ткани и лейкоциты под действием кислоты становятся бесцветными и приобретают цвет дополнительного красителя (синий).
№7 Этапы развития бактериологии. Принципы классификации бактерий. Понятие о виде, культуре, штамм, клон
Для бактерий рекомендованы следующие таксономические категории: класс, отдел, порядок, семейство, род, вид. Название вида соответствует бинарной номенклатуре, т. е. состоит из двух слов. Например, возбудитель сифилиса пишется как Treponema pallidum.Первое слово — название рода и пишется с прописной буквы, второе слово обозначает вид и пишется со строчной буквы. При повторном упоминании вида родовое название сокращается до начальной буквы, например: Т. pallidum.
Бактерии относятся к прокариотам, т. е. доядерным организмам, поскольку у них имеется примитивное ядро без оболочки, ядрышка, гистонов, а в цитоплазме отсутствуют высокоорганизованные органеллы (митохондрии, аппарат Гольджи, лизосомы и др.).
Вид. Одной из основных таксономических категорий является вид (species). Вид — это совокупность особей, объединенных по близким свойствам, но отличающихся от других представителей рода.
Чистая культура. Совокупность однородных микроорганизмов, выделенных на питательной среде, характеризующихся сходными морфологическими, тинкториальными (отношение к красителям), культуральными, биохимическими и антигенными свойствами, называется чистой культурой.
Штамм. Чистая культура микроорганизмов, выделенных из определенного источника и отличающихся от других представителей вида, называется штаммом. Штамм — более узкое понятие, чем вид или подвид.
Клон. Близким к понятию штамма является понятие клона. Клон представляет собой совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки.