Билет 5

1. Общие принципы выделения белков из тканей. Очистка и фракционирование. Обнаружение белков в растворах. Цветные и осадочные реакции на белки. Определение содержания белков в тканях и биологических жидкостях.

Для определения концентрации белков в биологических жидкостях и растворах используются оптические, колориметрические и азотометрические методы.

Оптические методы основаны на оптических свойствах белков. К ним относятся:

• спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

• рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

• нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

• поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Колориметрические методы основаны на цветных реакциях белков – биуретовая реакция, метод Лоури, метод сорбции белками определённых красителей. Интенсивность окраски определяется концентрацией белкового раствора.

Азотометрические методы основаны на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).

Выделение, фракционирование и очистка белков

Выделение белков из тканей включает несколько этапов.

1. Гомогенизация (измельчение) ткани для разрушения клеточных и внутриклеточных мембран, препятствующих выделению белков. В процессе гомогенизации нередко добавляются детергенты.

2. Экстрагирование (растворение) белков проводят чаще всего слабыми солевыми растворами.

3. Отделение низкомолекулярных веществ (солей) методом диализа с использованием полупроницаемых мембран, методом гель - фильтрации.

4. Очистка белка от сопутствующих белков (фракционирование), основанная на различных физико-химических свойствах белков.

а) ультрацентрифугирование – разделение белков по молекулярной массе;

б) электрофорез – разделение белков по заряду молекулы и молекулярной массе;

в) фракционное высаливание – подбор концентрации соли для осаждения различных белков;

г) хроматографические методы разделения:

• распределительная хроматография – по различной растворимости белков;

• гель-фильтрация – по различной молекулярной массе белков

• ионообменная хроматография – по разнице зарядов белковых молекул

• аффинная хроматография – по химическим свойствам различных белков

4. Выделение белка в кристаллическом состоянии проводится путём лиофилизации (высушивания) при низкой температуре.

2.Биосинтез и распад гликогена: последовательность реакций, значение. Регуляция активности указанных процессов. Гликогенозы. Обмен гликогена в анте- и в перинатальном периоде.

Гликоген – краткосрочный резерв углеводов в организме. Биосинтез гликогена наиболее активно происходит в печени в течение первых двух часов после приёма углеводов пищи (абсорбтивный период). Глюкоза поступает в гепатоциты и другие ткани с помощью особых переносчиков (ГЛЮТ - транспортёры глюкозы).

На первом этапе глюкоза активируется за счёт АТФ под действием ферментов глюкокиназы (при высоких концентрациях глюкозы) и гексокиназы (при невысоких концентрациях глюкозы).

Затем остаток фосфата переносится в первое положение:

Далее затрачивается макроэрг УТФ с образованием активной формы УДФ-глюкозы:

УДФ-глюкоза удлиняет молекулу гликогена на одну молекулу глюкозы:

Гликогенсинтетаза - регуляторный фермент синтеза гликогена, она активируется путём дефосфорилирования.

Распад два пути распада гликогена: амилолитический путь и фосфоролитический путь

Амилолитический путь заключается в гидролитическом распаде гликогена:

Этот путь катализируют α-амилаза, которая расщепляет внутренние 1,4 -α-гликозидные связи и γ - амилаза, которая отрывает концевые остатки глюкозы.

Основным способом распада гликогена является фосфоролитический путь при участии Н₃РО₄:

Глюкозо-1-фосфат переходит в глюкозо-6-фосфат под действием фермента фосфоглюкомутазы.

В печени имеются фермент – глюкозо-6-фосфатаза, способный отщеплять остатки Н₃РО₄ от глюкозо-6-фосфата, переводя глюкозо-6-фосфат в свободную глюкозу.

Фосфорилаза расщепляет только 1,4 -α-гликозидные связи. В расщеплении 1,6 -α-гликозидных связей участвует дополнительный фермент – 1,6 -α-гликозидаза.

Ключевым ферментом распада гликогена является фосфорилаза. В распаде гликогена участвуют активная фосфорилированная форма фосфорилазы (фосфорилаза «А»). Она образуется из неактивной фосфорилазы «В» путём фосфорилирования и увеличения олигомерности. Фосфорилаза «В» является нефосфорилированным димером, а фосфорилаза «А» представляет собой фосфорилированный тетрамер.

Синтез и распад гликогена подвержены авторегуляции при изменении концентрации глюкозы по приведенной схеме.