2.2.3.1 Приготовление агарозного геля

Все растворы для электрофореза готовятся заранее.

Для приготовления 1,5 % агарозного геля, мы добавляли 1,5 г агарозы к 100 мл буфера ТВЕ (1х). Нагревали смесь в. кипящей водяной бане до полного растворения агарозы. Охлаждали раствор агарозы до 50–55° С и добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. Заливали раствор в специальную электрофоретическую кювету и немедленно вставляли на расстоянии примерно 1 см от одного из концов кюветы гребенку для формирования лунок. Высота гребенки подбирается таким образом, чтобы между ее зубьями и дном кюветы оставался зазор в 0,5–1,0 мм. Оставляли камеру в строго горизонтальном положении до полного застывания геля при комнатной температуре (от 30 до 40 мин). Затем, аккуратно вынимали гребенку и помещали кювету с гелем в электрофоретическую камеру. Заполняли камеру 500 мл электрофоретического буфера ТВЕ (1х), чтобы он покрыл гель слоем.

2.3 Статистическая обработка результатов анализа

Для обработки результатов анализа электрофореза работали с пакетом программ Gel Explorer:

1 Gel Imager – программа для ввода и обработки изображений и устройств видеоввода

2 Gel Analysis – программа анализа изображения гелей. Предназначена для оценки количества и молекулярной массы НК и белков, содержащихся в исследуемых фрагментах.

Популяционно-генетический анализ. Частоту встречаемости аллелей определяли по следующей формуле:

(1)

где р^А – частота аллеля А, АА – количество гомозигот, Аа - количество гетерозигот, N – общее количество людей.

Расчет генного равновесия по закону Харди-Вайнберга, выполняли для определения, сохранено ли генное равновесие в данной выборке людей, или оно нарушено.

Соотношение фактических частот генотипов теоретически ожидаемым определяли по критерию χ².

Статистическую обработку проводили с помощью t-критерия Стьюдента.

3 Результаты и их обсуждение

Ген CYP2E1 содержит полиморфизм c1/с2, который повышает риск возникновения и развития алкоголизма.

Для молекулярно-генетического исследования полиморфизма c1/с2 в гене CYP2E1 были исследованы фрагменты ДНК, полученные из цельной венозной людей.

Выделение ДНК проводили фенольным методом с использованием протеиназы К. Полиморфизмы генов анализировали методом ПЦР, а разделение фрагментов ДНК проводили методом электрофореза в 1,5% агарозном геле.

В результате электрофоретического исследования на выявление полиморфизма c1/с2 нами были получены электрофореграммы (рисунок 3.1.1.1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

А)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Б)

Рисунок 3.1.1.1 – Электрофореграммы ядерной ДНК на выявление полиморфизма с1/с2 в гене CYP2E1:

А) норма; Б) патология

В мордовской популяции для полиморфизма с1/с2 в гене CYP2E1, согласно данным статистической обработки, частота нормального гомозиготного генотипа 27% (4 из 15 образцов). Встречаемость гетерозиготного генотипа наблюдалось у 53% (8 из 15 образцов). Встречаемость патологического генотипа составляет 20% (3 из 15 образцов) (рисунки 3.1.1.1 и 3.1.1.2).

Таблица 3.1.1.1 – Частоты встречаемости аллелей и генотипов изучаемого полиморфизма в группе больных и в группе контроля

Выборка	Ген/полиморфизм	Генотипы, %			Аллели,%
1	2	3	4	5	6	7
Группа контроля (n=60)	CYP2E1(1293G/C)	G/G	G/C	C/C	G	C
		32 n=4	53 n=8	8 n=3	83,3	16,7
Группа больных (n=63)	CYP2E1(1293G/C)	27 n=4	60 n=8	20 n=2	75,4	24,6

Рис 3.1.1.2 Распределение частот аллелей и генотипов полиморфизма 1293G/C гена CYP2E1

Популяционно-генетический анализ встречаемости частот генотипов по полиморфизму с1/с2 гена CYP2E1 в выборке здоровых и больных с патологиями показал, что частота нормального гомозиготного G/G генотипа в группе больных ниже, чем в группе контроля на 5 %. (таблица 3.1.1.1, рисунок 3.1.1.2). Встречаемость гетерозиготного G/А и патологического гомозиготного генотипа A/A оказалась выше в группе больных соответственно на 8 и 12% соответственно.

Таким образом цитохром 2E1, также как и другие ферменты суперсемейства P450 в зависимости от того или иного полиморфного варианта кодирующего гена влияют на физиологические и метаболитические процессы организма и нередко приводят к возникновению патологического процесса.