2.2.2 Проведение полимеразной цепной реакции (пцр)

Количество копий исследуемого локуса может быть увеличено с помощью амплификации (полимеразно-цепной реакции).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) предусматривает инкубацию образцов при трех температурах, соответствующих трем этапам цикла амплификации: денатурации ДНК, отжигу праймеров и пролонгации синтезируемой цепи. Обычно двуцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева образца до 90–96⁰ С, затем проводят отжиг, охлаждая образец до 40–65⁰ С, и далее нагревают до 70–75 ⁰С, чтобы осуществить достройку ДНК, начиная с отожженных затравок с помощью Taq-полимеразы.

Инструкция:

1 Приготовить и пронумеровать пробирки для проведения амплификации вместимостью 0,5 мл (или 0, 2мл) в соответствии с количеством анализируемых проб плюс отрицательный контроль. Для каждой пробы готовят 2 пробирки (N (норма) и P (патология)).

2 За 20–30 минут до приготовления рабочей амплификационой смеси извлечь комплект реагентов для ПЦР из морозильника, разморозить содержимое. Пробирки с реакционной смесью и полностью размороженным раствором разбавителя тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого.

3 Из компонентов комплекта приготовить рабочие смеси реагентов для амплификации из расчета на 1 пробу:

17,5 мкл разбавителя,

2,5 мкл реакционной смеси,

0,2 мкл Taq-полимеразы

Готовятся 2 рабочие смеси: с реакционной смесью НОРМА и с реакционной смесью ПАТОЛОГИЯ.

1. После добавления Taq-полимеразы, которое производится в последнюю очередь, необходимо тщательно перемешать смесь пипетированием.

2. Добавить по 20 мкл соответствующей рабочей амплификационной смеси во все соответствующие пробирки, подготовленные для амплификации.

3. Добавить во все пробирки по 1 капле (около 25 мкл) минерального масла.

4. Внести по 5 мкл образца из обработанной анализируемой пробы в пробирку с рабочей амплификационной смесью НОРМА и в пробирку с рабочей амплификационной смесью ПАТОЛОГИЯ под слой масла. В качестве отрицательного образца вносится разбавитель в объеме 5 мкл в оба типа реакционной смеси.

5. Пробирки закрыть и центрифугировать в течение 3-5 секунд при 1,5-3000 об/мин комнатной температуре (+18..+25° С) на микроцентрифуге-вортексе.

6. Перенести пробирки в прогретый до температуры +94° С (установившейся температура в режиме Пауза) программируемый термостат (амплификатор) и провести амплификацию по следующей программе:

При интерпретации результатов важно помнить о невозможности появления в данных анализах слабоположительных проб. Все полосы на электрофорезе должны быть четкими и примерно одинаковой интенсивности (допускаются небольшие различия в яркости как между тестами на норму и патологию, так и от пробы к пробе). Причинами появления малоинтенсивных полос на электрофорезе могут являться:

1 Ошибка при проведении анализа или некорректная работа амплификатора;

2 Частичное вытекание амплификата из кармана (малоинтенсивна как полоса ампликона);

3 Контаминация образца или затекание амплификата из соседнего кармана геля.

Во всех этих случаях необходимо повторить амплификацию и детекцию, а при повторном появлении малоинтенсивных полос - повторить анализ, начиная со стадии выделения ДНК из соответствующей пробы.

Полоса (длина ампликонов для каждого набора указана в таблице в начале инструкции)		Интерпретация резуультата
Реакционная смесь N (норма)	Реакционная смесь Р (патология)
+	-	Нормальная гомозигота
+	+	Гетерозигота
-	+	Патологическая (мутантная) гомозигота

2.2.3 Электрофорез ДНК в 1,5 % агарозном геле

Электрофорез в агарозном геле позволяет разделять молекулы ДНК по их размерам. Этот метод основан на сравнительном анализе исследуемого и стандартного препаратов ДНК на фотографии геля, окрашенного бромистым этидием, являющимся интеркалирующим красителем, связывающимся с ДНК. Ультрафиолетовый свет, поглощенный бромистым этидием и ДНК (возбуждение передается на краситель), испускается затем в виде флюоресценции в области видимого света при 590 нм.

Размер фрагментов ДНК определяли путем сравнения их подвижности с маркером (рестрикционные фрагменты фага ). Количественное определение ДНК в агарозном геле проводили путем сравнения яркости полос анализируемых фрагментов и стандартного препарата ДНК.

Минимальное количество ДНК, которое можно увидеть при фотографировании геля, окрашенного бромистым этидием, - 2 нг при ширине полосы 0,5 см (обычная ширина лунки), оптимальное количество - 40–60 нг.