1.4 Прикладное значение исследований полиморфизмов гена cyp2e1

В последнее время проводится все больше исследований по изучению полиморфизмов гена CYP2E1. Эти исследования имеют очень важное значение в медицинской генетике. С помощью ПЦР анализа можно обнаружить различные генетические полиморфизмы. Очень важно сравнивать частоту полимофного генотипа с нормальным генотипом в различных популяциях. Также большое значение уделяется исследованию внешних факторов. Довольно много проводится исследований посвященных изучению влияния мутагенных факторов (ионизирующие и электромагнитное излучение, УФ, различные химические вещества) на частоту полимофных и мутантных генотипов. Генетическая диагностика заболеваний до начала развития манифестных форм может предотвратить развитие заболевания или улучшить его клиническое протекание и дальнейший прогноз [7,29,39].

С использованием данных генотипирования полиморфизма генов ФМЭ, социально-биологических и психологических характеристик разработан способ индивидуального прогнозирования риска развития алкогольной зависимости. Полученные данные могут рассматриваться как предикторы алкоголизма, что открывает перспективы для научно обоснованного подхода к раннему выявлению, лечению и профилактике этого заболевания. На основании генотипирования полиморфизма генов ФМЭ, изучения социально-биологических и психологических характеристик разработана статистическая регрессионная модель вероятностного прогнозирования риска развития алкогольной зависимости. Использование модели в практике медико-генетического консультирования, психологической реабилитации, подразделений наркологических служб позволит своевременно формировать группу повышенного риска алкоголизма, оптимизировать и индивидуализировать лечебно-профилактические мероприятия [23,46,59].

1.5 Гены и их белковые продукты участвующие в развитии алкоголизма

Алкоголизм - непростое в генетическом плане заболевание.

Гены, ответственные за возможное развитие алкоголизма, влияют на многие физиологические процессы: на расщепление этанола, сбалансированность работы головного мозга, вкусовые ощущения и т.д. Изменения в этих генах могут вызывать как непереносимость алкоголя, так и тягу к нему. Некоторые генные версии связаны с другими признаками или расстройствами. Следовательно, отклонения в поведении, настроении и разного рода зависимости могут иметь общую первопричину [13,54].

Были идентифицированы особые участки хромосом 1, 2, 4 и 7, в которых по данным хромосомного картирования располагаются такие специфические гены, как АDН4 и GABRA2 (хромосома 4), а также СНRМ2 (хромосома 7).

В основе алкогольной зависимости лежат различные физиологические механизмы

Появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что некоторые варианты генов, которые кодируют рецепторы нейромедиатора гамма-аминомасляной кислоты, ассоциируются со склонностью к алкоголизму.

Как показали исследования, проведенные в рамках программы СОGА, нарушения в гене GABRA2, не сопровождающиеся изменением архитектуры рецептора ГАМКА, связаны с алкоголизмом. Была выявлена также связь между изменениями в гене СНRМ2 и клиническими проявлениями алкогольной зависимости и депрессии. Как и в случае с геном GABRA2, нарушения в гене СНRМ2, влияющие на биоэлектрическую активность мозга и связанные с развитием алкоголизма и депрессии, сопровождаются не структурными изменениями рецепторов, а уменьшением их числа. Гены отвечающие за предрасположенность к алкоголизму представлены в таблице1.

В метаболизме алкоголя участвуют два основных фермента. Сначала под действием алкогольдегидрогеназы этанол превращается в ацетальдегид, а далее ацетальдегид при помощи альдегиддегидрогеназы в ацетат. Работа этих ферментов, скорость их обмена обусловлены генетически и зависят от разных вариантов генов, кодирующих их.

Этанол (этиловый спирт) является достаточно токсичным соединением, и алкоголь наносит вред здоровью, хотя ряд исследований позволяет предположить пользу умеренного потребления, например, красного вина. Как выяснили ученые, все зависит от особенностей метаболизма алкоголя в организме человека.

Белок алкогольдегидрогеназа состоит из альфа-, бета- и гамма-субъединиц, каждая из которых кодируется соответствующим геном. Ген алкогольдегидрогеназы ADH1B кодирует бета-субъединицу белка ADH. На активность фермента может влиять замена одного нуклеотида в кодирующей ее последовательности ДНК. В процессе эволюции образовались два варианта данного гена. Основной вариант обозначается как *1 (или А), а вариант гена, произошедший в результате мутации, – как *2 (или G). Вследствие такой замены меняется активность фермента ADH. Многими авторами было показано увеличение активности фермента до 100 раз у лиц, имеющих генотип *2/*2, по сравнению с людьми, несущими основные варианты гена – *1/*1.

Таблица 1.5.1.1 - Гены ответственные за предрасположенность к алкоголизму

Ген; Локализация	Кодируемый белок; функция	Влияние	Связь с другими признаками или заболеваниями
CYP2E1, хромосома 10	Цитохром 2E1 фермент, участвующий в метаболизме этанола	Повышение риска (некоторые генные версии)	ГБ, АБП
АDН4; хромосома 4	Алкогольдегидрогеназа; фермент, участвующий в метаболизме этанола	Повышение риска (некоторые генные версии)	Нет
ALDH1; хромосома 4	Алкогольдегидрогеназа; фермент, участвующий в метаболизме этанола	Непереносимость алкоголя	Нет
CHRM2; хромосома 7	Мускариновый/ацетилхолиновый М2-рецептор; регулирует сигнальные процессы	Повышение риска	Депрессия; изменение характеристик дельта- и тета-волн на ЭЭГ
DRD2; хромосома 11	Дофаминовый D2-рецептор; регулирует активность системы вознаграждения	Повышение риска	Пристрастие к курению
GABRG3; хромосома 15	g3-субъединица ГАМКА-рецептора; регулирует сигнальные процессы	Повышение риска	Нет
НТАS2R16; хромосома 7	hTS2R16-рецептор; влияет на ощущение сладкого	Повышенный риск	Нет
ОРRК1; хромосома 8 РDYN; хромосома 20	Рецептор каппа-опиоида и продинор-фин, пептид, который связывается с этим рецептором; оба белка участвуют в регуляции влечения и отвращения к алкоголю	Повышенный риск	Реакция на стресс; может влиять на пристрастие к героину и

2 Материалы и методы

2.1 Объект исследования

Материалом для исследования послужили образцы ДНК, полученные из цельной венозной крови человека. Выборки больных людей с алкоголизмом на базе республиканского наркологического диспансера г. Саранска. Выборка составила – человек больные и человек здоровые (доноры) в качестве контрольной группы. В исследование были включены больные не родственные между собой.

2.2. Методы исследования

2.2.1 Выделение ДНК с использованием протеиназы К

1. Лизис эритроцитов

   1. В 1,5 мл пробирки внести последовательно 700 мкл цельной крови и 700 мкл буфера ТЕ 1(10 мМ трис-HCl и 1мМ ЭДТА). Перемешать со­держимое переворачиванием (8-10 раз).

   2. Центрифугировать при 11000 об/мин 6 мин.

   3. Супернатант удалить над видимым осадком лейкоцитов. Осадок тщательно суспендировать в 700 мкл буфера ТЕ1. Повторить процедуру 2—3 раза.

2. Лизис ядер клеток.

   1. К отмытому осадку добавить 300 мкл ТЕ 2 (20 мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТА, pH 7,4), тщательно перемешать и добавить 25 мкл 10% SDS, 10 мкл протеиназы. Инкубировать смесь 65°С 20 мин. Остудить про­бирки во льду 1 мин.

3. Осаждение ДНК.

   1. К лизату добавить 250 мкл 5,3 М NaCl для высаливания белков. Пере­мешать содержимое пробирок на вортексе до появления хлопьев.

   2. Центрифугировать смесь 6 мин при 10 тыс об/мин. Перенести супер- натат. содержащий ДНК, в новые пробирки не забирая осадок.

   3. Добавить 700 мкл холодного изопропанола. Перемешать переворачи­ванием пробирки 10-12 раз до выпадения видимого осадка ДНК.

   4. Центрифугировать смесь при 13 тыс об/мин 2 мин. Осторожно, не за­бирая нитей ДНК, удалить супернатант.

4. Промывка и растворение ДНК.

   1. Добавить 70% этанол до объема 1,5 мл. Встряхнуть на вортексе.

   2. Центрифугировать 2 мин при 13 тыс об/мин. Осторожно удалить су­пернатант, не забирая осадок.

   3. Открытые пробирки подсушить на воздухе до испарения спирта.

   4. Добавить к осадку 300 мкл буфера 0,1 М трис-HCl pH 8,5 (НЕ ТЕ!). Перемешать и прогреть при 65°С 5 мин до растворения ДНК.

   5. Полученный раствор ДНК хранить при -20°С. Допустимо кратковре­менное хранение раствора ДНК при +4 °С.