Полимеразная цепная реакция
ПЦР-анализ характеризуется высокой чувствительностью (100 - 1000 м.к./мл), специфичностью и быстротой выполнения анализа, а также возможностью выявлять микроорганизмы с измененным фенотипом. Специфичность ПЦР определяется подбором праймеров. В литературе описано достаточно много праймеров для амплификации разных областей генома сибиреязвенного микроба, что позволяет не только выявлять возбудителя сибирской язвы, но и дифференцировать штаммы по ряду признаков [ ].
По результатам разработки данного метода показан ряд положительных свойств ПЦР тест-системы "АмплиСенс Bacillus anthracis-FRT" для выявления В.anthracis рХ01+:
• продолжительность метода составляла 6 ч против 24 ч. при бактериологическом исследовании;
• на результаты анализа не влияет присутствие посторонней микрофлоры, которая при бактериологическом исследовании затрудняет получение чистой культуры. [ ]
Бактериологический метод
Воду с илистыми частицами фильтруют. Чистую воду исследуют без предварительной подготовки. С целью концентрирования микробов пробы воды можно профильтровать через мембранные фильтры или осадить
Тампоны, которыми делают смывы с объектов окружающей среды, отжимают о стенки пробирки и удаляют, а оставшуюся жидкость исследуют.
Пробы почвы освобождают от корней, камешков и тщательно перемешивают.
Для повышения эффективности выявления спор B. anthracis целесообразно проводить двукратную обработку образцов почвы диспергирующей жидкостью с 0,5% пирофосфата натрия.
Засевают на чашки Петри с МПА, агаром Хоттингера (pH 7,2), селективную дифференциально-диагностическую среду с 0,01% натрия фенолфталеинфосфата и пробирку с МПБ. Для засева одной пробы желательно использовать не менее 5 чашек. Из бульонной культуры делают мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. Кроме колоний сибиреязвенного микроба, на средах может наблюдаться рост спорообразующих сапрофитов, морфологически трудно отличимых от B. anthracis. Из всех отобранных колоний делают мазки на двух или более предметных стеклах. Мазки фиксируют и окрашивают двумя способами – по Ребигеру (или по Граму) и сибиреязвенной люминесцирующей соматической сывороткой. При просмотре мазков учитывают характерную для сибиреязвенного микроба морфологию (длинные нити, концы палочек обрублены) [ ]
Использование селективных сред упрощает выделение В. anthracis из объектов внешней среды, содержащих близкородственные бациллы, [ ], но появление в результате длительного нахождения в почве атипичных сибиреязвенных штаммов может сильно затруднять идентификацию патогена.
Бактериоскопия
Световая микроскопия
Для обнаружения спор в некоторых образцах внешней среды после фиксации мазки окрашивают карболовым фуксином по Цилю-Нильсену. Докрашивают мазок метиленовой синью Леффлера, смывают водой и просушивают. Препарат просматривают в микроскопе с иммерсионной системой. По результатам микроскопического исследования немедленно дают предварительный ответ.
Люминесцентная микроскопия - МФА
Люминесцентно-серологический метод основан на выявлении антигенов B.anthracis с помощью специфических сывороток, соединенных с флюоресцирующими красителями (Е.Н.Левина). Чувствительность этого метода весьма высока, однако он считается пригодным для выявления только вегетативных форм возбудителя сибирской язвы. При исследовании проб с объектов внешней среды целесообразно проводить выявление споровых форм возбудителя сибирской язвы обработкой люминесцирующими противоспоровыми сыворотками мазков из нативного материала. Для повышения чувствительности метода применяются механические методы концентрирования микробов центрифугированием или фильтрованием через мембранные фильтры. [ ]
Для люминесцентной микроскопии делают мазки-отпечатки из экссудата брюшной полости и органов биопробных животных, мазки из подозрительных колоний, выросших из посевов проб на чашках с питательными средами. В исходных пробах могут быть обнаружены сибиреязвенные микробы в вегетативной или споровой форме. Мазки из смывов, суспензий, вытяжек из материалов, подозрительных на высокую контаминацию возбудителем сибирской язвы, обрабатывают диагностическими люминесцирующими адсорбированными антиспоровыми иммуноглобулинами.
В случае приготовления мазков непосредственно из нативного материала их окрашивают для увеличения контрастности смесью диагностических иммуноглобулинов и бычьего альбумина, меченого родамином. [ ]