Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.М.СЕЧЕНОВА

Министерства здравоохранения Российской Федерации

ИНСТИТУТ ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

МЕДИКО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА ЭПИДЕМИОЛОГИИ

ФБУН Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии РОСПОТРЕБНАДЗОРА г. Москвы

Научно-практическая работа

Оценка лабораторной диагностики сибирской язвы в объектах окружающей среды

Исполнитель: Мушкетова Анна Алексеевна, интерн кафедры эпидемиологии

Руководитель: Симонова Елена Геннадьевна, д.м.н., профессор кафедры эпидемиологии

Куратор кафедры: Симонова Елена Геннадьевна, д.м.н., профессор кафедры эпидемиологии

Москва, 2015 г.

Содержание

Введение 3

Актуальность 3

Цели и задачи исследования 4

Обзор литературы 5

Собственные исследования 14

Выводы и рекомендации 30

Список используемой литературы 31

Введение.

Сибирская язва относится к группе зоонозов. Заражение происходит при уходе за больными животными, прирезке, снятии шкуры, разделке туши, обработке полученных от таких животных сырья и продуктов питания, при контакте с изделиями из такого сырья т.п. [ ]

Актуальность.

В настоящее время сибирская язва продолжает представлять серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран мира, включая Россию. [ ]. Несмотря на успехи, достигнутые в изучении эпизоотологии и эпидемиологии сибирской язвы, в настоящее время полная ликвидация инфекции не представляется возможной в связи с существованием естественных резервуаров сибиреязвенного микроба, каковыми являются сибиреязвенные скотомогильники. Вспышки сибирской язвы у сельскохозяйственных животных наносят значительный экономический ущерб и представляют собой реальную угрозу заболевания людей. На территории России учтено более 35 тыс. стационарно-неблагополучных пунктов, где существуют почвенные очаги, обусловливающие эпидемический потенциал инфекции [ ]. Устойчивость сибиреязвенного микроба в почве, обусловленная феноменальной способностью спор сохраняться десятилетиями [ ], способствует возникновению потенциально опасных по сибирской язве территорий, что приводит к развитию эпизоотических и эпидемических вспышек этого заболевания[ ].

В целях обнаружения В. anthracis в старых захоронениях и подозрительных в контаминации территориях, и не допущения возможного распространения спор возбудителя заболевания за пределы саркофага проводятся лабораторные исследования объектов окружающей среды. В старых сибиреязвенных скотомогильниках на глубине 150-200 см выделяются атипичные культуры, однако при многократном пассаже на лабораторных животных они способны восстанавливать вирулентность и свойства, соответствующие референтным штаммам. [ ]

По многочисленным литературным данным, с помощью используемых в настоящее время микробиологических методов удается выделить микроб сибирской язвы даже из заведомо инфицированных участков почвы не более чем в 1-3% исследуемых проб. Эти данные свидетельствуют о необходимости усовершенствования используемой в практике здравоохранения схемы бактериологического исследования внешней среды на обсемененность Bac.anthracis.

Сложившаяся в настоящее время ситуация по сибирской язве и определила цель нашего исследования.

Цель: Оценка качества и эффективности лабораторной диагностики сибирской язвы в почве, воде, иле.

Задачи исследования:

1. Изучить существующие методы лабораторной диагностики сибирской язвы и провести их сравнительный анализ.

2. Проанализировать результаты лабораторных исследований на наличие возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды в различных эпидемиологических ситуациях.

3. Оценить качество и эффективность лабораторной диагностики в зависимости от применяемых методов и средств.

4. Разработать рекомендации по применению наиболее эффективных методов и средств.

Обзор литературы.

Сибирская язва относится к инфекциям основным источником возбудителя для животных, которых в последние десятилетия стала почва. Однако до настоящего времени в арсенале практических врачей отсутствуют методы, позволяющие объективно оценить уровень зараженности мест сибиреязвенных захоронений и степень их эпидемической опасности. Применяемые утвержденные методы обнаружения B.anthracis характеризуются высокой трудоемкостью, низкой чувствительностью и эффективностью выделения - 0,6 - 9,7 % [ ].

1. Материал для исследования, взятие, пересылка материала и подготовка проб для исследования

Все работы по забору, транспортированию и подготовке проб из объектов окружающей среды осуществляют в строгом соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности)», СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности", МУ 1.3.1794-03 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I - II групп патогенности".

Для исследования берутся следующие объекты окружающей среды - почва, трава, фураж, подстилка, вода и т.д. Забор всех видов материала (кроме почвы) осуществляется в стерильную стеклянную или пластиковую посуду, соответствующую объему проб.

Взятие материала из сырья животного происхождения и из объектов внешней среды проводится в тех случаях, когда необходимо установить источник инфекции или фактор передачи, для выявления обсемененности спорами возбудителя сибирской язвы отдельных объектов, а также в целях обнаружения микроба в местах старых скотомогильников при проведении строительных, мелиоративных, гидротехнических и других работ, связанных с выемкой и перемещением грунта. [ ]

Пробы почвы помещают в мешочек из плотной ткани с завязками или в лабораторную посуду (широкогорлый флакон, банку), закрытую такой же тканью. Нельзя помещать пробы почвы в полиэтиленовые мешочки или в плотно закрытую посуду, так как в этих условиях происходит бурное развитие актиномицетов, губительно действующих на возбудитель сибирской язвы. При отборе проб почвы следует руководствоваться "Методическими рекомендациями по отбору проб почвы для бактериологического исследования на наличие возбудителей сибирской язвы и актиномицетов-антагонистов". Пробы почвы с мест вероятного обсеменения спорами возбудителя (мест вынужденного убоя скота, стоянок и водопоя животных) берут на глубине до 15 см, на территории скотомогильников - на глубине до 2 м с помощью почвенных буров. При этом при заборе проб с большой территории обследуемую площадь разбивают на квадратные участки со стороной не более 4 м. В каждом квадрате намечают 5 точек по диагонали или 4 точки по краям и одну посередине, откуда производят отбор проб почвенным буром. [ ].

Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут у поверхности (на глубине 10-15 см) и у дна при помощи батометра или специально приспособленной бутыли. Объем каждой пробы не менее 0,5 л, общий объем не менее 1 л. Кроме того, берут пробы придонного осадка у береговой кромки, которые исследуют так же, как пробы почвы. [ ]

Смывы делают с мест наиболее вероятного обсеменения спорами возбудителя с помощью стерильного тампона, смоченного стерильной дистиллированной водой. Площадь смыва одним тампоном около 100 кв. см. Затем тампоны помещают в пробирки, заливают стерильной дистиллированной водой (15 мл) и закрывают пробкой. [ ]

Пробы воздуха отбирают с помощью специальных приборов, снаряженных сорбирующей жидкостью или фильтрами.

Пробы почвы, кормов и других сыпучих объектов помещают в сухую стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом, можно использовать полиэтиленовые мешочки (кроме проб почвы), которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Допускается использование одноразовых стерильных или многоразовых автоклавируемых пластиковых флаконов. Все пробы нумеруют, емкости заворачивают в лигнин или гигроскопическую вату в количестве, достаточном для сорбции всей жидкости в случае повреждения упаковки. Пробы упаковывают во влагонепроницаемую тару, которую обвязывают, пломбируют или опечатывают, делают надпись "верх, осторожно". Пробы материала и сопроводительные документы доставляются нарочным на спецтранспорте. В сопроводительной к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал и в каком количестве направляют, место и дату отбора материала. Для проб шерсти и кормов дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц. К сопроводительной прилагают опись с указанием места отбора каждой пробы. [ ]

1. Проведение лабораторных исследований

Методы обнаружения возбудителя сибирской язвы на различных объектах внешней среды разделяют на сигнальные (ускоренные) и заключительные. Сигнальные методы исследования позволяют ориентировочно судить о наличии B.anthracis в изучаемом материале и требуют в дальнейшем обязательного проведения заключительных исследований, которые являются решающими.

Инструкцией по исследованию воды, почвы, смывов с объектов внешней среды на присутствие возбудителя сибирской язвы, утвержденной Министерством здравоохранения СССР 12 июня 1965 г., предусмотрены следующие сигнальные методы исследования:

• люминесцентно-серологический метод.

• метод по выявлению капсулообразования на среде ГКИ.

• метод по выявлению капсулообразования на мышцах.

В зависимости от конкретных условий эти методы могут взаимозаменять друг друга, однако при обязательном условии одновременного применения хотя бы двух из них. Сигнальные методы, основанные на выявлении капсулообразования, непригодны в редких случаях присутствия на объектах внешней среды акапсулогенных штаммов возбудителя сибирской язвы, поэтому Э.Н.Шляхов и Е.В.Груз (1967) предлагают включить в число сигнальных методов тест на лизабельность со специфическим бактериофагом.

Заключительные методы исследования, направленные на выделение чистой культуры и изучение ее свойств, включают: изучение подвижности и морфологии культуры, постановку пробы с пенициллином, определение чувствительности к специфическому бактериофагу, пробу на желатине, определение вирулентности культуры на лабораторных животных.

Были достигнуты значительные успехи в области познания структуры и функций генетического аппарата сибиреязвенного микроба [ ]. Определена полная нуклеотидная последовательность двух собственных плазмид (pXOl и рХ02), проведена серия работ по генотипированию [ ]. Это явилось предпосылкой разработки новых молекулярно-генетических методов детекции и идентификации В. anthracis.

Из геннодиагностических методов наиболее широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), ставшая в последние годы стандартной лабораторной методикой, регламентированной МУ 1.3.-1794-03 "Организация и проведение генодиагностических исследований биологического материала, пищевых продуктов и объектов окружающей среды, зараженных бактериями I-II групп патогенности".

Схема 1. Общая схема лабораторного исследования проб окружающей среды на сибирскую язву

Образцы из объектов окружающей среды

РНГА

Прогревание при 80 0С, 20 мин.

Микроскопия мазков, МФА

ПЦР

Биопроба

Посев на селективный дифференциально-диагностический агар, агар Хоттингера

ПЦР

Посев на сектора МПА, АГАРА Хоттингера, МПБ

Микроскопия мазков,МФА

Чистая культура

Идентификация культур