18. Методика постановки и оценка результатов реакции преципитации в агаре

Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена под действием специфических антител. Для получения видимой реакции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции преципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.

Реакция преципитации в геле агара проводится несколькими методами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.

• Реакция двойной иммунодиффузии (по Оухтерлони)

Растопленный агаровый гель выливают в чашку Петри и после затвердения в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие - иммунные сыворотки, которые диффундируют в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белых полос.

• Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини)

В растопленный агаровый гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застывания агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, которые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антигена, тем больше диаметр кольца.

Реакцию применяют, например, для определения в крови иммуноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов Ig G, Ig M, Ig A действуют в этой реакции как антигены, а антитела против них содержатся в специфических монорецепторных сыворотках.

• Иммуноэлектрофорез

В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направлению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образуются линии преципитации.

18. Методика постановки и оценка результатов цветной пробы

Цветная проба основана на разнице в цвете среды индикатором фенолрот, в которой растёт нормальная, жизнеспособная культура клеток, и среды, где находится культура, заражённая вирусом. В процессе развития нормальной культуры клеток происходит постепенное накопление кислых продуктов обмена веществ, что приводит к сдвигу рН в кислую сторону. Такое изменение реакции среды говорит о наличии роста и размножения клеток. Среда с индикатором фенолрот, первоначально имевшая красный цвет (рН 7,4-7,6), вследствие снижения рН до 7,0-6,8 приобретает жёлтый цвет.

Заражение культуры клеток вирусом приводит к развитию в ней дегенеративных процессов: происходит подавление процессов метаболизма, значительно понижается гликолиз, в результате чего кислых продуктов накапливается мало, рН среды остаётся на исходном уровне и среда с индикатором фенолрот остаётся красного цвета.

С помощью цветной реакции можно определить соответствие вируса и вируснейтрализующей сыворотки, если их предварительно смешать и эту смесь после инкубации внести в культуру клеток. Специфическая сыворотка нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры.

Цветную пробу ставят с различными типами клеточных культур. Чаще берут первичную культуру клеток почки обезьяны или перевиваемые (клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время) культуры клеток. При постановке цветной реакции необходимо учитывать, что каждая культура клеток, на которой ставят реакцию, имеет определённый уровень метаболизма. Устанавливают дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество клеток, которое должно быть взято в каждую пробирку.

При работе с культурой почечных клеток обезьяны готовят взвесь клеток густотой 100-200 тыс. в 1 мл. Из неё делают ряд возрастающих разведений в объёме 0,25 мл и определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в жёлтый на 5-6-й день выдерживания в термостате; это количество и принимается за дозу клеток. Обычно эта доза – 25 тыс. клеток в объёме 0,25 мл.