7. Методика обнаружения бактериофага в исследуемом материале

Выделение фага из объектов окружающей среды

Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал (вода, суспензия фекалий и др.) через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37°С в течение 18-24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественным и количественным методами.

1. Качественный метод определения фагов

Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой бактерий газоном и подсушивают при 37°С в течение 10-15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага.

2. Количественный метод - определение титра фага по методу Грациа

Для постановки опыта предварительно:

а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате;

б) приготовленный полужидкий (0,7 %) питательный агар, разлитый по 3-4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане.

Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10^-2 – 10^-7 в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (10^-7) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выливают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45°С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя.

Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10^-6) с бактериями и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем - из разведения 10^-5. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37°С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси.

Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага – титр.

8. Порядок действий при приготовлении препарата «висячая капля»

Для приготовления препарата небольшую каплю суспензии микроорганизмов наносят на покровное стекло, переворачивают его каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением в центре, края которого предварительно обмазаны вазелином.

Если имеют дело с культурой на жидкой среде, то маленькую капельку культуры прямо наносят на тщательно вымытое покровное стекло; если же имеется культура на плотной среде, то на покровное стекло предварительно наносят маленькую капельку водопроводной воды или физиологического раствора, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии размешивают в приготовленной капельке. Можно также заранее приготовить взвесь микроорганизмов в физиологическом растворе и взять капельку из нее.

Предметное стекло слегка прижимают к покровному, в результате чего оба стекла склеиваются. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. Под микроскопом край капли сначала отыскивают со слабым увеличением и при суженной диафрагме, а потом исследуют препарат при помощи более сильной сухой или иммерсионной системы.

9. Порядок действий при приготовлении препарата «раздавленная капля»

На обезжиренное предметное стекло прокаленной петлей наносят каплю стерильной воды, в которую той же петлей вносят небольшое количество исследуемой культуры микроорганизма (дрожжей или бактерий), взятой с твердой питательной среды. Из жидкой среды культуру берут вместе с каплей жидкости, а при надобности добавляют каплю стерильной воды. Суспензия культуры микробов на стекле должна давать лишь слабую муть.

При микроскопировании дрожжей в каплю жидкости на стекле добавляют петлей небольшое количество метиленовой сини (до голубого окрашивания) и всю эту смесь тщательно размешивают. Прижизненная окраска дрожжей метиленовой синью применяется для того, чтобы выявить мертвые клетки, легко окрашивающиеся в синий цвет. Живые клетки остаются неокрашенными, так как не пропускают краску через свою оболочку. Приготовленный на предметном стекле препарат дрожжей накрывают покровным стеклом и рассматривают с объективом 40Х.

Препарат живых бактерий готовится подобно препарату дрожжей, но бактерии рассматривают без добавления краски. На поверхность покровного стекла наносится капля иммерсионного масла, и препарат рассматривается с иммерсионным объективом 90X, лучше всего в затемненном поле (т.е. с прикрытой диафрагмой). Если культура бактерий подвижная, то хорошо видны быстрые разнохарактерные движения отдельных клеток.

При приготовлении препаратов в раздавленной капле нужно помнить следующее:

1. При опускании покровного стекла на каплю следует прикоснуться его ребром к краю капли и, постепенно наклоняя, опустить стекло.

2. Капля не должна быть большой, чтобы жидкость не переливалась за края и не попадала на верхнюю сторону покровного стекла. Избыток воды снимают кусочком фильтровальной бумаги.

3. Одиночные пузырьки воздуха, оставшиеся под покровным стеклом, обычно не мешают наблюдению. Но если пузырьков много, препарат следует приготовить заново.

4. Препарат не должен быть слишком густым, чтобы микроорганизмы не заслоняли друг друга.

5. Приготовленные препараты рассматривают немедленно (особенно живых бактерий), так как в противном случае вода высыхает и клетки бактерий теряют подвижность.

6. Бактериологическую петлю (или иглу) перед каждым очередным пассажем и после него (нанесение капли воды на стекло, снятие культуры с агара и ее размешивание, взятие краски и т.д.) следует обязательно докрасна прокаливать в пламени горелки.

После прокаливания петлю быстро охлаждают на воздухе (держат 2-3 сек, ни к чему не прикасаясь).