4. Методи вивчення спадковості.

Сучасна клінічна медицина вже не може обійтися без генетичних методів. Для вивчення спадкових ознак у людини використовують різні біохімічні, морфологічні, імунологічні, електрофізіологічні методи. Лабораторно-генетичні методи діагностики завдяки прогресу генетичних технологій можуть бути виконані на малій кількості матеріалу, який можна пересилати поштою (декілька крапель крові на фільтрувальному папері, або навіть на одній клітині, взятій на ранній стадії розвитку У вирішенні генетичних завдань використовують такі методи: генеалогічний близнюковий, цитогенетичний, гібридизації соматичних клітин, молекулярно-генетичні, біохімічні, методи дерматогліфіки і пальмоскопії, популяційно-статистичний, секвенування геному тощо.

Генеалогічний метод вивчення спадковості людини. Основний метод генетичного аналізу в людини полягає у складанні і вивченні родоводу. Генеалогія - це родовід. Генеалогічний метод - метод родоводів, коли простежується ознака (хвороба) в родині з указанням родинних зв'язків між членами родоводу. В його основу покладено ретельне обстеження членів родини, складання й аналіз родоводів. Це найбільш універсальний метод вивчення спадковості людини. Він і використовується завжди при підозрі на спадкову патологію, дозволяє встановити у більшості пацієнтів:

• спадковий характер ознаки;

• тип успадкування і пенетрантність алеля;

• характер зчеплення генів і здійснювати картування хромосом;

• інтенсивність мутаційного процесу;

• розшифрування механізмів взаємодії генів.

Моногенним називається такий тип успадкування, коли спадкова ознака контролюється одним геном. Досліджував закономірності моногенного успадкування видатний вчений Г. Мендель. Відомо понад 100 видів метаболічних аномалій у людини, які успадковуються згідно з менделівською моногібридною схемою, наприклад, галактоземія, фенілкетонурія, різні форми гемоглобінопатії та інші. Ознаки, які підпорядковуються або успадковуються за закономірностями, встановленими Г. Менделем називаються менделюючими ознакам. Моногенні - це такі спадкові захворювання, які визначаються одним геном, - моногенно (від грец. μόνος - один), тобто коли прояв захворювання визначається взаємодією алельних генів, один з яких домінує над іншим.

Цей метод застосовують при медико-генетичному консультуванні. Суть генеалогічного методу полягає у встановленні родинних зв'язків, простеженні ознак або хвороби серед близьких і далеких, прямих і непрямих родичів. Він складається із двох етапів: складання родоводу і генеалогічного аналізу. Вивчення успадкування ознаки або захворювання в певній сім'ї розпочинається з суб'єкта, який має цю ознаку або захворювання. Особина, яка першою попадає в поле зору генетика, називається пробандом. Це переважно хворий або носій дослідної ознаки. Діти однієї батьківської пари називаються сибсами пробанда (брати - сестри). Потім переходять до його батьків, далі до братів і сестер батьків і їх дітей, потім до дідусів і бабусь і т.д. Складаючи родовід, роблять короткі нотатки про кожного з членів сім'ї, його родинні зв'язки з пробандом. Схема родоводу супроводжується позначеннями під рисунком і отримала назву легенди. Застосування генеалогічного методу дозволило встановити характер успадкування гемофілії, ахондроплазії та ін. Він широко використовується для уточнення генетичної природи патологічного стану і при складанні прогнозу здоров'я нащадків.

Складання родоводу розпочинають з пробанда - людини, яка звернулася до генетика або до лікаря і містить ознаку, яку необхідно вивчити у родичів по батьківській і материнській лініях. При складанні родовідних таблиць користуються умовними позначеннями, запропонованими Г. Юстом у 1931 р. Після складання родоводу до нього додається письмове пояснення - легенда родоводу. У легенді мають знайти віддзеркалення такі відомості:

• результати клінічного і позаклінічного обстеження пробанда;

• відомості про особистий огляд родичів пробанда;

• зіставлення результатів особистого огляду пробанда з відомостями опитування його родичів;

• письмові відомості про родичів, які проживають в іншій місцевості;

• висновок щодо типу успадкування хвороби або ознаки.

Не слід обмежуватися при складанні родоводу тільки опитуванням родичів - цього недостатньо. Частині з них призначають повне клінічне, позаклінічне або спеціальне генетичне обстеження. Мета генеалогічного аналізу полягає у встановленні генетичних закономірностей. На відміну від інших методів, генеалогічне обстеження повинно завершуватися генетичним аналізом його результатів. Аналіз родоводу дає можливість дійти висновку щодо характеру ознаки (спадкова чи ні), тип успадкування (аутосомно-домінантний, аутосомно- рецесивний або зчеплений зі статтю), зиготності пробанда (гомо- або гетерозиготний), ступеня пенетрантності й експресивності досліджуваного гена

За аутосомно-домінантним типом успадковуються деякі нормальні і патологічні ознаки:

• біле пасмо волосся;

• волосся жорстке, пряме;

• шерстисте волосся - коротке, кучеряве, пишне:

• товста шкіра;

• здатність згортати язик трубочкою;

• габсбургська губа;

• полідактилія - багатопалість, коли кількість пальців досягає 6-9 на ногах або руках;

• синдактилія - зрощення м'яких або кісткових тканин фаланг двох і більше пальців;

• брахідактилія-короткопалість, недорозвинення дистальних фаланг пальців;

За аутосомно-домінантного типу успадкування домінантні гени фенотипно виявляються в гетерозиготному стані і тому визначення їх і характер успадкування не викликає утруднень.

Прикладом аутосомно-домінантного типу успадкування може бути характер успадкування шестипалості. Шестипалі кінцівки – явище досить рідкісне, але стійко зберігається у багатьох поколіннях деяких родин. Багатопалість стійко повторюється в нащадків, якщо хоча б один із батьків багатопалий, і відсутня в тих випадках, коли в обох батьків кінцівки нормальні. У нащадків багатопалих батьків ця ознака присутня в рівній кількості у хлопчиків і дівчаток. Дія цього гена в онтогенезі з'являється досить рано і має високу пенетрантність. При аутосомно-домінантному типі успадкування ризик появи хвороби в нащадків, незалежно від статі, складає 50 %, але прояви захворювання певною мірою залежать від пенетрантності. Аналіз родоводів показує, що за таким типом успадковуються: синдактилія, хвороба Марфана, ахондроплазія, гіпербілірубінемія, гіпер- ліпопротеїнемія, різні дизостози, мармурова хвороба, незавершений остеогенез, нейрофіброматоз Реклінгаузена, отосклероз, хвороба Пельціуса - Мерцбахера, полідактилія, порфирія гостра інтермітуюча, птоз спадковий, таласемія, фавізм, хвороба Шарко - Марі, хвороба Штурге-Вебера, множинні екзостози, ектопія кришталика, еліптоцитоз.

Якщо рецесивні гени локалізовані в аутосомах, то появляються вони тільки при шлюбі двох гетерозигот або гомозигот за рецесивним алелем. За аутосомно-рецесивним типом успадковуються такі ознаки в людини:

• волосся пряме, тонке,

• шкіра тонка,

• перша група крові,

• група крові Rh-,

• хвороби обміну речовин (фенілкетонурія, галактоземія тощо.)

Частота виникнення аутосомно-рецесивного захворювання знаходиться в прямій залежності від ступеня поширеності мутантного гена. Ймовірність рецесивних спадкових хвороб особливо зростає в ізолятах та популяціях, в яких багато близькородинних шлюбів. Це зумовлено тим, що тут "концентрація" гетерозиготного носійства вища, ніж у загальній популяції. Аутосомно-рецесивний тип успадкування має ряд відмінних рис:

За аутосомно-рецесивного успадкування рецесивні гени фенотипно виявляються тільки в гомозиготному стані, що затруднює як виявлення, так і вивчення характеру успадкування. Цьому успадкування властиві такі закономірності:

• якщо хвора дитина народилася у фенотипно нормальних батьків, то батьки обов'язково гетерозиготи;

• якщо уражені сибси народилися від близько- родинного шлюбу, то це доказ рецесивного успадкування захворювання;

• якщо вступають у шлюб хворий на рецесивне захворювання і генотипно нормальна людина, всі їх діти будуть гетерозиготами і фенотипно здорові;

• якщо вступають у шлюб хворий і гетерозигота, то половина їх дітей будуть уражені, а половина — гетерозиготні;

• якщо вступають у шлюб двоє хворих на одне те ж рецесивне захворювання, то всі їх діти будуть хворі.

• чоловіки і жінки хворіють з однаковою частотою:

• гетерозиготи фенотипно нормальні, але є носіями однієї копії мутантного гена;

• уражені індивіди гомозиготні, а їх батьки -гетерозиготні носії.

Аналіз родоводів свідчить, що фенотипне виявлення рецесивних генів відбувається тільки в тих сім'ях, де ці гени мають обоє батьків хоча би в гетерозиготному стані. Рецесивні гени в людських популяціях залишаються невиявленими. Проте у шлюбах між близькими родичами або в ізолятах (невеликі групи людей), де відбуваються шлюби за близьких родинних зв'язків, являються. Спадкові хвороби передаються переважно за аутосомно-рецесивним типом. Серед них амавротична сімейна ідіотія, аутоімунна гемолітична анемія, галактоземія, гермафродитизм, хвороба Гоше, євнухоїдизм, мікседема, серповидноподібноклітинна анемія.

Низка захворювань успадковується за Х-зчепленим типом. Розрізняють Х-зчеплене домінантне та Х-зчеплене рецесивне успадкування.

Статеві хромосоми, крім визначення статі, виконують і інші функції, оскільки містять гени, які впливають на різні системи органів. Успадкування ознак і властивостей, зумовлених генами, локалізованими в статевих хромосомах, називається успадкуванням, зчепленим зі статтю. Це явище було відкрито Т. Морганом. Характер зчепленого зі статтю успадкування істотно залежить від того, в яких статевих хромосомах і в яких їх ділянках розміщені ті чи інші гени. Ознаки, зчеплені зі статтю, виявлено у дводольних рослин, багатьох тварин і людини. Є певні характерні особливості успадкування ознак, зчеплених зі статтю. Гени, що локалізовані в X- хромосомі, як і при аутосомному успадкуванні, можуть бути домінантними і рецесивними. Відмінною рисою Х-зчепленого успадкування є відсутність передачі відповідного гена від батька до сина - вони передають свою Х-хромосому тільки донькам. Якщо в Х-хромосомі розташований домінантний ген, такий тип успадкування називається Х-зчепленим домінантним. Для родоводу Х-зчепленого домінантного типу успадкування характерно:

• уражені чоловіки передають своє захворювання дочкам, але не синам;

• уражені гетерозиготні жінки передають захворювання половині своїх дітей незалежно від їх статі;

• уражені гомозиготні жінки передають захворювання всім своїм дітям.

Якщо в Х-хромосомі локалізується рецесивний ген - тип успадкування називається Х-зчепленим рецесивним. Такий тип успадкування зустрічається не часто. Захворювання у жінок перебігає не так тяжко, як у чоловіків. Для родоводу Х-зчепленого рецесивного успадкування властиві такі закономірності:

• майже всі уражені - чоловіки;

• ознака завжди передається через гетерозиготну матір, яка фенотипно здорова;

• уражений батько ніколи не передає захворювання своїм синам;

• всі дочки ураженого батька будуть гетерозиготними носіями;

• жінка-носій передає захворювання половині своїх синів, жодна з дочок не буде хворою, але половина дочок - носії спадкового гена.

Більше 300 ознак зумовлені мутантними генами, розташованими в Х-хромосомі. Прикладом успадкування рецесивного гена, зчепленого зі статтю, може бути гемофілія. Захворювання відносно часто зустрічається в чоловіків і дуже зрідка у жінок. Фенотипово здорові жінки іноді бувають "носіями" і при шлюбі із здоровим чоловіком народжують синів, хворих на гемофілію. Такі жінки гетерозиготні за геном, який зумовлює втрату здатності до згортання крові. Від шлюбів хворих на гемофілію чоловіків із здоровими жінками завжди народжуються здорові сини і дочки-носії, а від шлюбів здорових чоловіків з жінками-носіями половина синів буває хворими і половина дочок - носії. Як вже зазначалося, це пояснюється тим, що батько передає свою Х-хромосому дочкам, а сини отримують від батька тільки Y-хромосому, яка ніколи не містить гена гемофілії, тоді як їх єдина Х-хромосома переходить від матері.

Якщо в ген локалізується в У- хромосомі, успадкування називається У-зчепленим (голандричним). Хромосома У містить відносно невелику кількість генів. До початку 2002 року у ній карбовано тільки 35 генів. З них 7 здатні викликати спадкові захворювання. Серед них пігментний ретиніт, гонадобластому, порушення диференціювання статі. При У-зчепленому успадкуванні відмічаються такі особливості:

• при У- зчепленому успадкуванні усі сини хворого батька будуть хворими;

• доньки хворого батька та їх діти будуть здоровими.

Близнюковий метод. Метод полягає у вивченні закономірностей успадкування ознак моно- і дизиготних близнюків. На даний час його широко застосовують у вивченні спадковості й мінливості людини для визначення співвідносної ролі спадковості і середовища у формуванні нормальних і патологічних ознак. Він дозволяє виявити спадковий характер ознаки, визначити пенетрантність алеля, оцінити ефективність дії на організм деяких зовнішніх чинників (лікарські препарати, навчання, виховання). Суть методу полягає в порівнянні прояву ознаки в різних групах близнюків із зважанням на подібність або розходження їхніх генотипів. Монозиготні близнюки, що розвиваються з однієї заплідненої яйцеклітини, генетично ідентичні, оскільки мають 100% загальних генів. Тому серед монозиготних близнюків спостерігається дуже високий відсоток конкордатних пар, у яких розвивається ознака в обох близнюків. Порівняння монозиготних близнюків, що виховуються за різних умов постембріонального періоду, дозволяє виявити ознаки, у формуванні яких істотна роль належить чинникам середовища. За цими ознаками між близнюками спостерігається дискордантність, тобто розходження. Встановлення співвідносної ролі спадковості і середовища в розвитку різноманітних патологічних станів дозволяє лікареві вірно оцінити ситуацію і проводити профілактичні заходи при спадковій схильності до захворювання. Труднощі близнюкового методу пов'язані, по перше, з відносно низькою частотою народження близнюків у популяції (1:86-1:88), що ускладнює добір достатньої кількості пар з даною ознакою; по-друге, з ідентифікацією монозиготності близнюків, що має велике значення для одержання достовірних результатів. За допомогою близнюкового методу проведені численні дослідження природи схильності до серцево-судинних хвороб.

Цитогенетичний метод, його значення. Цитогенетичний аналіз дозволяє записувати діагноз спадкового захворювання у вигляді каріотипічної формули. Цитогенетичний метод (метод хромосомного аналізу) ґрунтується на мікроскопічному дослідженні структури і кількості хромосом. Він набув широкого застосування у 20-і роки XX ст, коли було отримано перші відомості про кількість хромосом у людини. У 30-х роках були ідентифіковані перші 10 пар хромосом. У 1956 р. шведські вчені Дж. Тийо і А. Леван вперше довели, що у людини 46 хромосом. Цитогенетичний метод використовують для:

• вивчення каріотипів організмів;

• уточнення числа хромосомних наборів, кількості і морфології хромосом для діагностики

• хромосомних хвороб;

• складання карт хромосом;

• для вивчення геномного і хромосомного мутаційного процесу;

• вивчення хромосомного поліморфізму в людських популяціях.

Ц ей метод дозволяє діагностувати багато спадкових хвороб, вивчати мутаційний процес, складні перебудови і найменші хромосомні аномалії у клітинах, які вступили у фазу поділу та поза поділом. На хромосомний аналіз направляються пацієнти з множинними уродженими вадами розвитку, діти з затримкою фізичного і психомоторного розвитку,пацієнти з недиференційованими формами олігофренії (недоумства), з порушенням статевого диференціювання, жінки з порушенням менструального циклу (первинна або вторинна аменорея), сім'ї з безпліддям, жінки зі звичним невиношуванням вагітності (викидні, мертвонароджені).

Каріотип визначають таким чином:

1. Береться кров з вени (8-10 мл);

2. Лейкоцити виділяють шляхом осадження еритроцитів центрифугуванням або 10% розчином желатину;

3. У стерильних боксах на спеціальному середовищі (близько 50 інгредієнтів) лімфоцити діляться;

4. На три доби культуру клітин поміщають у термостат за температури 37⁰С;

5. За годину до фіксації додають розчин колхіцину, який затримує мітоз на стадії метафази;

6. Клітини переносять в гіпотонічний розчин натрію хлориду. Оболонка ядра розривається і хромосоми переходять в цитоплазму;

7. Клітини переносяться на предметне скло і забарвлюються за методом Романовського – Гімзи абл Фельгена;

8. Отриманий мікропрепарат розглядають під мікроскопом з імерсією;

9. Хромосоми фотографують;

10. Із збільшеної фотографії вирізають зображення усіх хромосом. Гомологічні пари розкладають у порядку зменшення. На останньому місці розташовують пару статевих хромосом. Таким чином утворюється ідеограма;

11. Ідіограму аналізують.

Аналіз ідіограми:

1. Визначають загальну кількість хромосом;

2. Визначають статеві хромосоми;

3. Записують каріотип. Для цього спочатку вказують загальну кількість хромосом, ставлять кому і вказують статеві хромосоми. Наприклад, нормальний каріотип жінки: 46, ХХ; нормальний каріотип чоловіка: 46,ХУ.

4. Додаткову хромосому позначають відповідним номером і знаком + (якщо хромосома зайва), або ж знаком – (якщо хромосома відсутня). Наприклад 47,ХУ,21+ (чоловік з синдромом Дауна). Полісомію статевих хромосом записують так: 47; ХХУ (синдром Кляйнфельтера). Моносомію статевих хромосом так 45, Х0;

Молекулярно-генетичні методи. Це різноманітна група методів, що застосовуються для виявлення варіацій у структурі досліджуваної ділянки ДНК, а також для розшифровування первинної послідовності основ. Ці методи ґрунтуються на "маніпуляціях" з ДНК і РНК.

Біохімічні методи. Біохімічні методи спрямовані на виявлення біохімічного фенотипу організму. Вперше біохімічні методи почали застосовувати для діагностики генних хвороб ще на початку XX сторіччя. За останні роки їх широко використовують для пошуку нових мутантних алелів. За їхньою допомогою описано понад 1000 спадкових хвороб обміну речовин. Найбільш поширеними серед таких захворювань є хвороби, пов'язані з дефектом ферментів, структурних, транспортних або інших білків.

М етод дерматогліфіки. Дерматогліфіка (від грец. δέρμα - шкіра і γλυφέ - гравірувати) - наука, що вивчає спадкову обумовленість малюнку, який утворюють лінії шкіри на кінчиках пальців, долонях і підошвах людини. Дерматогліфіка поділяється на: дактилоскопію - вивчення малюнка пальців; пальмоскопію — вивчення особливостей будови долонь; плантоскопію - вивчення особливостей будови підошов. Метод запропоновано в 1892 ρ. Φ. Гальтоном як один із шляхів вивчення шкірних гребінчастих візерунків пальців і долонь, а також згинальних долонних борозен. Встановлено, що візерунки є індивідуальною характеристикою людини і не змінюються впродовж життя. Дерматогліфічні дослідження мають важливе значення у визначенні зиготності близнюків, у діагностиці багатьох спадкових захворювань, а також в окремих випадках спірного батьківства.

Популяційно-статистичний метод. За допомогою популяційно-статистичного методу вивчають спадкові ознаки у великих групах населення, в одному або декількох поколіннях. Цим методом можна розрахувати частоту прояву в популяції різноманітних алелів гена і різні генотипи за цими алелями, з'ясувати поширення в ній спадкових ознак, зокрема, захворювань. Він дозволяє вивчити мутаційний процес, роль спадковості і середовища у формуванні фенотипного поліморфізму людини за нормальними ознаками, виникнення хвороб зі спадковою схильністю. Цей метод використовують і для з'ясування значення генетичних чинників в антропогенезі, зокрема, в расоутворенні.

Секвенування геному людини. Методи секвенування - визначення нуклеотидної послідовності ДНК. Перевага ДНК-діагностики в тому, що об'єктом дослідження є молекули ДНК, тому її можна проводити не тільки на тих тканинах, де працюють ("експресуються") відповідні гени, але й на інших клітинах організму, з яких можна виділити ДНК, і на будь-якій стадії розвитку. Досимптомна діагностика спадкових захворювань, зокрема пренатальна діагностика, заснована на дослідженні клітин плоду, навіть проембріональних стадій розвитку (гамети, зиготи, зародки).

Консультування з приводу прогнозу нащадків можна розділити на дві великі групи: проспективне і ретроспективне. Проспективне консультування - це найбільш ефективний вид профілактики спадкових хвороб, коли ризик народження хворої дитини визначається ще до настання вагітності чи на ранніх її етапах. У цьому випадку подружжя, направлене на консультацію, не має хворої дитини, але існує певний ризик її народження, що ґрунтується на даних генеалогічного дослідження, анамнезу чи перебігу даної вагітності. Ретроспективне консультування - це консультування щодо здоров'я майбутніх дітей після народження в родині хворої дитини.

Завдання медико-генетичного консультування:

• Встановлення точного діагнозу природженого чи спадкового захворювання.

• Визначення типу успадкування захворювання в даній родині.

• Розрахунок величини ризику повторення захворювання в родині.

• Пояснення змісту медико-генетичного прогнозу тим людям, що звернулися за консультацією.

• Диспансерне спостереження і виявлення групи підвищеного ризику серед родичів індивіда зі спадковою хворобою.

• Пропаганда медико-генетичних знань серед лікарів і населення.

Показання для медико-генетичного консультування:

• Народження дитини з природженими вадами розвитку.

• Встановлена чи підозрювана спадкова хвороба в родині.

• Затримка фізичного розвитку чи розумова відсталість у дитини.

• Повторні спонтанні аборти, викидні, мертво- народження.

• Близькоспоріднені шлюби.

• Вік матері старше 35 років.

• Несприятливі впливи факторів зовнішнього середовища в ранній термін вагітності (інфекційні захворювання, особливо вірусної етіології; масивна лікарська терапія; рентген-діагностичні процедури; виробничі шкідливості).

• Несприятливий перебіг вагітності.