Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции

Подготовка клеток и тканей

Выявление антигенов в клетках и тканях с помощью иммуногистохимии осуществляется в несколько этапов. Исследуемые образцы замораживаются или заключаются в парафин, режутся на микротоме и помещаются на предметные стекла. Затем срезы освобождаются от парафина, на них проводят демаскирование антигенов, блокируют неспецифическое связывание белков и эндогенную пероксидазную активность и затем проводят инкубацию с первичными антителами. Связавшиеся первичные антитела выявляют, добавляя вторичные антитела, конъюгированные при помощи полимера с пероксидазой хрена, и осуществляют визуализацию вторичных антител при помощи субстрата – диаминобензидина. После достижения максимальной интенсивности окрашивания, срезы промывают водой для прекращения реакции, докрашивают гематоксилином и заключают в заливочную среду.

Для ИГХ пригоден практически любой материал: цитологические мазки, свежезамороженная или фиксированная ткань.

Контроль иммуногистохимической реакции

При любом иммуногистохимическом исследовании необходимо использовать различные контрольные тесты для оценки адекватности методической процедуры. Для подобных процедур исследуют стекла с тканью положительного и негативного контроля для того, чтобы убедиться в том, что 1) система визуализации работает адекватно, 2) положительное или негативное окрашивание является специфичным, 3) полностью соблюдена методическая последовательность.

Контроль ИГХ реакции означает оценку специфичности взаимодействия антител с тканевыми антигенами. С этой целью используют отрицательный и положительный контроль.

Отрицательный контроль.

Для отрицательного контроля берут срезы тканей, в которых заведомо нет искомого антигена. Результаты реакции должны быть отрицательными.

При проведении ИГХ реакции исключают инкубацию с первичными антителами, заменяя их неиммунной сывороткой. Результаты реакции должны быть отрицательными.

Положительный контроль.

В любом опыте важно иметь положительный контроль – окрашивать ткань, заведомо содержащую исследуемые антигены, для того чтобы убедиться, что все антитела работают нормально. В качестве положительного контроля служат срезы тканей, в которых исследуемый антиген заведомо присутствует. Результаты реакции должны быть положительными.

Значение клеточных белков в оценке гистогенеза опухолей

Для иммуногистохимического анализа опухолей и их метастазов применяется широкий спектр маркеров, к которым можно отнести:

тканеспецифические белки – белки промежуточных филаментов (ПФ),

компоненты базальной мембраны,

рецепторы, молекулы клеточной адгезии и др.

Для иммуногистохимической верификации опухолей человека используют антитела к белкам ПФ.

Промежуточные филаменты вместе с микротрубочками и микрофиламентами составляют цитоскелет всех клеток эукариотов. Свое название ПФ (диаметр 10 нм) получили из-за того, что они тоньше микротрубочек (диаметр 24 нм), но толще микрофиламентов (диаметр 7 нм). Основная функция ПФ – создание внутриклеточного каркаса, механическое поддерживание плазматической мембраны в местах соприкосновения с другими клетками и внеклеточным веществом, а также поддержание ядерной оболочки. ПФ не подвергаются циклическим изменениям, как это происходит с микрофиламентами и микротрубочками. В клетке ПФ достаточно стабильны, даже после обработки клеток детергентами они остаются интактными, в то время как большинство микротрубочек и микрофиламентов в клетках деполимеризируются до растворимых форм.

Наиболее многочисленной группой белков ПФ являются цитокератины. Цитокератины – белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток. Клетки различных эпителиев имеют разные молекулярные формы цитокератина.

В настоящее время выявлено 20 типов цитокератинов CK1-CK20. Спектр цитокератинов в эпителиальных клетках зависит от типа дифференцировки, положения клетки в эпителиальном пласте.