Біохімічні методи

Ці методи використовуються для діагностики хвороб обміну речовин, причиною яких є зміни активності певних ферментів. За допомогою біохімічних методів діагностовано близько 500 молекулярних хвороб, які є наслідком фенотипового проявлення мутантних генів. Ці методи відрізняються значною трудомісткістю, вимагають спеціального обладнання і тому не можуть бути широко використані для масових популяційних досліджень з метою раннього виявлення хворих із спадковою патологією обміну. Практично в усіх випадках біохімічна діагностика включає 2 рівні: первинний і уточнюючий. Метою первинного рівня діагностики є виключення здорових індивидів з подальшого обстеження, для цього використовують 2 види програм діагностики: масові та селективні.

Масові просіюючі програми використовують для діагностики у новонароджених таких захворювань як фенілкетонурія, вроджений гіпотериоз, муковисцидоз, галактоземія. Такі програми також використовуються для виявлення захворювань, поширених у певних групах населення. Наприклад, в США організована просіююча біохімічна програма з виявлення гетерозиготних носіїв ідіотії Тей-Сакса (вона найчастіше зустрічається серед євреїв-ашкеназі). На Кипрі та в Італії організовано біохімічне дослідження гетерозиготних носіїв таласемії. Програма складається з двох етапів. На першому етапі серед великої кількості обстежених необхідно виділити хворих, які мають певне спадкове відхилення від норми в обміні речовин. Така програма називається просіюючою, або скринінг-програмою. Для цього етапу зазвичай використовується невелика кількість простих, доступних методик (експрес-методів). Другий етап проводиться з метою уточнення (підтвердження діагнозу або відхилення при хибно-позитивній реакції на першому етапі). Для цього використовуються точні хроматографічні методи визначення ферментів, амінокислот тощо. Застосовують також мікробіологічні тести, які засновані на тому, що деякі штами бактерій можуть зростати тільки на середовищах, які містять певні амінокислоти або вуглеводи.

Селективні діагностичні програми передбачають перевірку біохімічних аномалій обміну в пацієнтів з підозрою на генні спадкові хвороби. У селективних програмах можуть використовуватися прості якісні реакції (наприклад, тест з хлоридом заліза для виявлення фенілкетонурії або тест з динитрофенілгідрозином для виявлення кетокислот у сечі) або більш точні методи. Наприклад, за допомогою тонкошарової хроматографії сечі та крові можна діагностувати спадкові порушення обміну амінокислот і мукополісахаридів. За допомогою електрофорезу гемоглобинів діагностується вся група гемоглобинопатій.

Біохімічний метод є основним у діагностиці багатьох моногенних захворювань, що причинюють порушення обміну речовин. Об’єктами біохімічної діагностики є біологічні рідини: кров, сеча, пот, амніотична рідина тощо. За допомогою даного методу можна визначити в біологічних рідинах активність ферментів або вміст деяких продуктів метаболізму.

Широке використання знайшов біохімічний метод у пренатальній діагностиці вроджених вад розвитку. Біохімічні методи включають визначення рівня альфа-фетопротеїна, хоріоничного гонадотропина в сироватці крові вагітної. Ці методи є просіюючими для виявлення вроджених вад розвитку. Наприклад, при дефектах невральной трубки підвищується рівень альфа-фетопротеїну в крові.

Молекулярно-генетичний метод є найбільш ефективним методом діагностики спадкових захворювань. Основною метою цього методу є діагностика мутацій, дослідження їх асоціації із спадковими захворюваннями, а також виявлення гетерозиготних і гомозиготних носіїв мутації. По суті, молекулярна діагностика є найбільш об'єктивним методом верифікації спадкових захворювань. Знаходження мутантних генів у гомозиготному чи гетерозиготному станах відповідно при рецесивних або домінантних захворюваннях є безперечним підтвердженням діагнозу. Перевага ДНК-діагностики у порівнянні із іншими методами молекулярної генетики людини у тому, що цей метод дозволяє виявити та дослідити саме першопричину захворювання (ген, його локалізація, тип ушкоджень). Цей метод дозволяє виявити навіть мінімальні порушення первинної структури ДНК (в тому числі однонуклеотидні заміни), які неможливо дослідити іншими методами.

ДНК-діагностика є малоінвазивною процедурою (достатньо 1-2 мл крові, букального епітелію, або декількох клітин матеріалу плоду, взятого в першому триместрі вагітності). Крім того подібний аналіз у разі виявлення мутації не потребує повторення, достатньо одного дослідження за життя пацієнта та навіть після його смерті. Цей метод потребує обов’язкової першої стадії – отримання зразку ДНК. Наступний аналіз проводиться в залежності від поставлених задач дослідження. Основними методами ДНК-діагностики є: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), фрагментний аналіз продуктів ПЛР із використанням різних видів гель-електрофорезу ДНК, визначення нуклеотидної послідовності ДНК за допомогою секвенування.

Онтогенетичний метод базується на вивченні особливостей проявлення певної ознаки або захворювання протягом індивідуального розвитку. Більшість ознак формується в пренатальному періоді. Після народження закінчується формування кори головного мозку, поступово формується психика дитини, її здатність до навчання, відбувається становлення імунної системи. У різні періоди розвитку організму відбувається зміна активності генів, причому може спостерігатися як «включення» та «виключення» генів, так і «посилення» та «послаблення» їхньої дії. У постнатальний період, наприклад, відбувається включення генів, що визначають розвиток вторинних статевих ознак, спадкових захворювань (цукрового діабету, короткозорості, міопатії Дюшена та інших). У похилому віці відбувається виключення багатьох генів: репресується активність генів, що обумовлюють продукування меланину (як наслідок відбувається посивіння волосся), не синтезується еластаза (з’являються зморшки), пригнічується продукування гама-глобулінів ( підвищується схильність до бактеріальних інфекцій). З віком рецесивні гени здатні впливати на розвиток тієї чи іншої ознаки. У випадку гетерозиготності за фенілкетонурією в людини змінюється психика.

Разом з терміном «час дії генів» використовують термін «поле дії генів». У кожній клітині людини, за виключенням зрілих статевих клітин, міститься однаковий диплоїдний набір хромосом та однаковий набір генів. Але в процесі онтогенезу та формування органів і тканин певні гени блокуються, інші включаються в роботу. Так, наприклад, тільки в клітинах щитовидної залози «працюють» гени, що контролюють синтез гормону тироксину, а в клітинах підшлункової залози – гормону інсулину. У клітинах інших органів також є такі гени, але вони блоковані.

У людини в процесі онтогенезу формується також конституція. Конституційні ознаки мають складне генетичне підґрунтя або можуть виникати в результаті раннього фізичного навантаження. Конституційними ознаками називають ознаки статури, функції або поведінки, характерні для процесів росту, дозрівання та старіння. Лікарі почали все більше звертати увагу на конституційні хвороби. З’ясовано, що люди астеничної тілобудови більш схильні до розвитку туберкульозу легень, і, навпаки, у людей з надмірною вагою найчастіше спостерігається атеросклероз і гипертонічна хвороба.

Популяційний метод дозволяє дослідити поширеність окремих генів або хромосомних аномалій у популяціях. Метод базується на методах математичної і варіаційної статистики. Для аналізу генетичної структури популяції необхідно обстежити велику за розмірами вибірку, котра має бути репрезентативною — об’єктивно відображати всю генеральну сукупність, тобто всю популяцію в цілому. У вибірці встановлюють розподілення організмів за відповідними чітко визначеними фенотиповими класами, відмінності між котрими є спадково обумовленими. Потім, виходячи з найдених фенотипових частот, визначають генні частоти. На основі знання генних частот можна описати популяцию, що аналізується, у відповідності з формулою Гарді-Вайнберга та передбачити ймовірний характер розщеплення в потомстві осіб, які відносяться до певних фенотипових класів. Розподілення генних частот у популяції має важливе значення для оцінки наслідків родинних шлюбів, а також для вияснення структури генофонду людської популяції.

Мутаційний метод базується на вивченні мутагенного ефекту радіоактивних і хімічних речовин, використанні цитологічного аналізу оцінки частоти і характеру хромосом­них аберацій (мутацій).