9.2. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного

Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне живого организма (in vitro) имеет большое значение для решения ряда научных задач и практических вопросов по повышению эффективности разведения животных.

Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает следующие этапы:

1. Созревание ооцитов in vitro. Ооциты получают из яичников коровы после убоя животных. Яичники доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение 1,5 - 2 часов. Там их дважды промывают свежим фосфатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов путем отсасывания или разрезания яичников на пластинки. Ооциты собирают в среду ТСМ 199 с добавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro ооциты с компактным кумулюсом и однородной цитоплазмой.

В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или лапароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр которых не менее 2 мм, 1 - 2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5-6 ооцитов на животное. Для созревания in vitro пригодно менее 50% ооцитов.

Отобранные ооциты созревают в течение 24 часов в среде ТСМ 199 с добавлением 20 % обработанной теплом сыворотки крови от коровы в охоте, гранулезных клеток и небольшого количества антибиотиков (пенициллина, стрептомицина).

2. Капацитация сперматозоидов. До того как сперматозоид приобретает способность к оплодотворению, в нем должны произойти некоторые физиологические изменения. Этот процесс получил название капацитация.

Капацитация включает две фазы: 1) изменение мембраны спермия (собственно капацитация); 2) акросомная реакция.

Разработаны следующие методы капацитации спермиев: использование среды с высокой ионной силой; использование гликозаминогликана гепарина.

3. Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов (на примере КРС). Оплодотворение in vitro проводят в капле модифицированной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частично очищают от окружающих кумулюсных клеток и переносят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 2 - 5 мкл добавляется к среде с ооцитами, чтобы достичь концентрации сперматозоидов в каплях 1,0 - 1,5 млн./мл. Через 44 - 48 часов после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают в монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.

Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных. Пересадка эмбрионов, например, овец козам и наоборот сопровождается их приживляемостью, но не завершается рождением потомства. Во всех случаях межвидовых беременностей непосредственной причиной абортов является нарушение функции плаценты за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода. Эта несовместимость может быть преодолена получением химерных эмбрионов с помощью микрохирургии.