- •Міністерство освіти і науки україни Дніпропетровський національний університет імені Олеся Гончара
- •Біохімічна відповідь олігодендроцитів до ішемічного стану
- •Oligodendrocytes' biochemical response to the ischemic condition
- •1. Огляд літератури
- •1. 1. Структура та функції мієліну
- •2. Мієлінізація протягом постнатального розвитку гризунів
- •3. Структурно-функціональні зміни олігодендроглії за ішемічного стану головного мозку
- •1. 3. 1. Типи ішемії
- •3. 2. Вплив гіпоксіє-індукованого фактору на стан мієліну
- •Руйнування мієліну Відростки
- •3. 3. Вплив ішемії мозку на експресію основного білка мієліну
- •3. 4. Дегенерація олігодендроцитів та їх відновлення після фокальної ішемії мозку
- •3. 5. Енергетичний дефіцит олігодендроцитів за умов ішемії
- •2. Матеріали і методи досліджень
- •2. 1. Об'єкт дослідження
- •2. Ізадрин-пітуїтринова модель ішемії
- •2. 3. Отримання білкових фракцій з мозку піддослідних тварин
- •2. 4. Непрямий імуноферментний аналіз
- •2. 5. Визначення вмісту загального протеїну (зп) за методом Бредфорд
- •6. Статистична обробка отриманих даних
- •Результати та їх обговорення
- •3. 1. Основний білок мієліну протягом раннього постнатального розвитку
- •3. 2. Загальний протеїн протягом раннього постнатального розвитку
- •3. 3. Загальний протеїн за умов ішемії
- •3. 4. Основний білок мієліну за умов ішемії
- •Висновки
- •Список літературних посилань:
- •Hafidi, a. Macroglia distribution in the developing and adult inferior colliculus / a. Hafidi, d. Galifianakis // Brain Res. Dev. – 2003. – Vol. 143. – № 2. – р. 167–177.
2. 4. Непрямий імуноферментний аналіз
Концентрацію основного білка мієліну (ОБМ) у мозку тварин визначали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). ІФА займає одне з провідних місць в імунологічних дослідженнях. Це метод, який поєднує в собі високу специфічність імунологічних реакцій з чутливою з чутливою каталітичною дією ферментів [58]. Нині ІФА використовується для вивчення будови і функції білків, їхнього біосинтезу і катаболізму, для визначення широкого класу речовин – гормонів, онкомаркерів, серцевих алкалоїдів, антибіотиків та інших фармакологічних речовин, а також вірусів, бактерій і антитіл проти них тощо [57].
Для всіх варіантів методу ІФА загальним є те, що в них як реагент використовуються антитіла або антигени, ковалентно зв’язані з ферментами-маркерами. Цей метод має надзвичайно високу чутливість, він дозволяє визначити речовини у кількості до 10-12 моля в зразку об’ємом не більше 0,1 мл. Ще одна особливість методу ІФА – його висока специфічність, котра взагалі характерна для імунологічних методів. Об’єднання в методі ІФА імунологічних і ферментативних реакцій створює особливості, які не властиві кожній з цих реакцій, якщо вони проходять нарізно. Методу ІФА притаманна висока здатність до автоматизації майже всіх етапів, що дозволяє проводити експрес-аналіз з високим ступенем відтворення.
Основними компонентами методу ІФА є антиген, антитіло і фермент- маркер [58]. Фактично будь-яка модифікація твердофазного ІФА базується на таких принципах:
1. Значна кількість різних антигенів (білки, полісахариди, ліпополісахариди) здатні зв’язуватися з полістероловим пластиком. Це стосується й антитіл, що є білки. Важливо при цьому те, що вони зберігають здатність зв’язувати антигени. Саме ця властивість використовується на першому етапі ІФА, коли сенсибілізують антигени або антитіла на поверхні твердої фази. В адсорбованому стані антитіла та антигени не змиваються з поверхні твердої фази буфером, який містить деяку невелику кількість детергенту, тоді як незв’язані реагенти легко відмиваються таким розчином. При використанні комерційних наборів для ІФА фірми, які виготовляють ці набори, беруть на себе цей етап аналізу і постачають набори з вже сенсибілізованими на твердій фазі (наприклад, на поверхні лунок планшета) антигенами чи антитілами.
2. Далі в сенсибілізованих лунках планшета інкубують зразки, які досліджуються, і стандартні (калібрувальні) реагенти. У цьому випадку на поверхні твердої фази формуються імунні комплекси, що складаються з одного або декількох шарів (залежно від виду аналізу). Компоненти, що не зв’язалися, на кожному етапі видаляють промивкою буфером з детергентом.
3. На наступному етапі аналізу з іммобілізованими імунними комплексами реагує штучний кон’югант «антитіло-фермент» або «антиген-фермент». Потрібно зазначити, що фермент і антитіло, що входять до складу кон’юганта, зберігають нативні властивості, тобто фермент здатний взаємодіяти з субстратом і каталізувати специфічну хімічну реакцію, а антитіло може взаємодіяти з антигеном. Далі наступна інкубація з розчином субстрату приводить до розвитку кольорової реакції. Хід реакції при досягненні необхідної інтенсивності забарвлення зупиняють додаванням реагенту, що зупиняє реакцію, а результат аналізу оцінюється за оптичною щільністю розчину субстрату (візуально або за допомогою ІФА-рідеру).
Кількісне визначення ОБМ у фракціях тканин мозку проводили згідно зі стандартною методикою непрямого твердофазного імуноферментного аналізу з використанням козячих моноспецифічних поліклональних антитіл проти ОБМ та вторинних антикозячих анти-IgG, мічених пероксидазою (Santa Cruz Biotechnology, USA) та високоочищеного ОБМ (Sigma, USA) в якості стандарту. Отримані результати вимірювали за допомогою ІФА-рідера Anthos 2010 (Фінляндія) при 492 нм. Отримані результати вимірювали за допомогою ІФА-рідера Anthos 2010 при 492 нм [57]. Рівень основного білка мієліну в отриманих фракціях виражали у мкг на 100 мг тканини мозку.