Полимеразная цепная реакция - пцр

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), другое название локальная амплификация нуклеоиновых кислот (ЛАНК) - это метод, при помощи которого, можно обнаружить, выделить и размножить определенную последовательность ДНК ( ген). ПЦР применяется для клонирования геномных последовательностей, секвенирования ДНК. В настоящее время ПЦР становится ценным молекулярно-генетическим диагностическим методом, позволяющим выявлять наличие латентных вирусов, а также обнаруживать патогенные микроорганизмы. ПЦР находит примене­ние при диагностике латентных вирусных инфекций, ВИЧ-инфекций, холеры, легионеллезов, микобактариозов.

Суть метода. При амплификации с помощью ПЦР использу­ют два олигонуклеотидных праймера (затравки), которые фланкируют (окаймляют) интересующий участок ДНК, и комплементарны двум нитям обнаруживаемой ДНК.

Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с компле­ментарными последовательностями и последующей достройкой полинуклеотидных цепей с этих праймеров при помощи ДНК-полимеразы.

Праймеры ориентированы таким образом ( комплементарны 5 концам обеих нитей ДНК), что синтез с помощью полимеразы протекает в направлении 5`- 3` только между ними, удваивая количество копий этого фрагмента. В результате происходит экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК по формуле 2ⁿ, где n число циклов амплификации. Продукт амплификации выявляют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле или авторадиографией.

Реакция высокоспецифична. Если исследуемый образец ДНК не обладает комплементарностью по отношению к праймерам, то реакция не пойдет.

Для реакции используют термостабильную ДНК - полимеразу, выделенную из бактерии Thekmus aguaticus (Tag-полимеразу).

Реакций проводят в 0,5-1,5 мл микроцентрифужных пробир­ках Эппендорф в автоматических амплификаторах, которые авто­матически регулируют смену температуры.

ПЦР предусматривает инкубацию образцов при З температурах, соответствующих трем этапам цикла полимеризации (амплификации): денатурации, отжига ДНК, достройки.

Денатурация протекает при 90-95°С, приблизительно 0,5-1 минуту. Отжиг проводится при температуре 40-60°С 0,5мин.

Удлинение ДНК протекает при температуре 70-75°С в течение 2-5 минут.

Реакционная смесь состоит из исследуемого образца ДНК, 2 праймеров, специфичных в отношении связывания с исследуе­мыми образцами, термостабильной ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.

Правила постановки пцр – пример использования коммерческой тест-системы -1

В программе стандартной ПЦР выделяют следующие стадии :

1.Предварительная денатурация – 5-7 мин при 94-95 ⁰С;

2.Около 30 – 42 циклов с шагами: денатурация при 94-95 ⁰С продолжительностью от 10сек до 1 мин ® присоединение (отжиг) праймеров при 45-65 ⁰С продолжительностью от 10сек до 1 мин ® достраивание (синтез) ДНК при 72 ⁰С продолжительностью от 10сек до 1 мин;

3. Завершающее достраивание - при 72 ⁰С продолжительностью 7-10 мин

Во многих программах амплификации стадии 1 и 3 отсутствуют.

В ОТ-ПЦР или ПЦР с обратной транскрипцией стадии 1 предшествует стадия обратной транскрипции – 30- 60 мин при 37- 42 ⁰С . Эта реакция проходит с участием специального фермента – обратной транскриптазы или ревертазы, которая на матрице РНК синтезирует ДНК- копию (кДНК). Затем кДНК вносится в пробирку с реакционной смесью и проводится стандартная ПЦР.

Образцы ДНК могут быть контаминированы, ингибировать ПЦР или не содержать ДНК, поэтому критическим моментом для исследования является включение контролей, чтобы проверить все эти возможные осложнения

• Положительный контроль

• Отрицательный контроль

• Контроль ингибиции или внутренний контроль

Визуализация результатов ПЦР достигается различными способами, в зависимости от используемого формата реакции

1. При использовании электрофоретического разделения продуктов амплификации для обнаружения ампликонов используется окрашивание ДНК. Самый распространенный способ – окраска бромистым этидием с последующим просвечиванием геля на ультрафиолетовом трансиллюминаторе. Молекулы этого красителя встраиваются в структуру нуклеиновых кислот (интеркаляция). Полосы ДНК при УФ-облучении светятся красным цветом. Этот метод высокочувствителен, но бромистый этидий является мутагеном и требует осторожного обращения. Применяется также окрашивание солями серебра, но этот метод менее чувствителен. Для регистрации результатов пользуются фотографированием обычными фотокамерами, цифровыми фото- и видеокамерами, соединенными с компьютерами. Ряд программ позволяет не только сохранять изображение, но и рассчитывать размеры ампликонов и количество ДНК

2. Еще один подход основан на использовании флюорохромов, которые излучают свет разных цветов. Флуорохромами метят праймеры, после амплификации электрофорез проводят в специальном приборе – автоматическом секвенаторе, который помимо своего прямого назначения- определения последовательности ДНК, позволяет также вести анализ фрагментов амплификации и получать компьютерное изображение полос

3. Различные варианты гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР – после амплификации ампликоны с включенными биотинилированными праймерами вносят в лунки микропланшета с иммобилизированными одноцепочечными зондами к этим фрагментам, проводят гибридизацию и после отмывки добавляют авидин и пероксидазу или авидин и фосфатазу, субстрат для фермента и выявялют окрашенный продукт с помощью фотометра. Регистрируют результат распечаткой на принтере.

4. При осуществлении ПЦР в реальном времени визуализация флуоресценции осуществляется с помощью фотодиодов, входящих в детектирующее устройство термоциклера, может отображаться на мониторе и регистрируется в памяти управляющего компьютера.