Иммунопрофилактика вирусных инфекций.

Вирусные вакцины. Вакцинация имеет большое значение в профилактике вирусных инфекций. В настоящее время известны следующие виды вирусных вакцин:

1. Вакцины из живых аттенуированных вирусов.

2. Корпускулярные (вирионные) убитые вакцины.

3. Субъединичные вакцины.

4. Генноинженерные вакцины.

5. Синтетические вакцины.

Последние два типа вакцин находятся в стадии разработки и практически еще не применяются.

Живые вакцины готовятся из аттенуированных вирусов, полученных разными приемами: отбором мелких колоний, t-s – мутантов, адаптированных к холоду мутантов. Живые вакцины вызывают в организме развитие гуморального и клеточного иммунитета, реакция сходна с естественным процессом, но слабо выражена. Недостатки: возможность реверсии к патогенности и необходимость постоянного контроля; контаминация другими вирусами и микоплазмами, т.к. используется субстрат (куриные эмбрионы, экспериментальные животные, культуры клеток); аллергизация организма; ограниченный срок действия.

Естественной живой вакциной был вирус коровьей оспы, который Дженнер в 1796 г. Привил ребенку. Примером эффективности вакцинопрофилактики является выдающийся успех в борьбе с оспой, завершившийся ее ликвидацией во всем мире. Большие успехи достигнуты в борьбе с полиомиелитом. В нашей стране была получена живая полиомиелитная вакцина из штаммов Сейбила, установлена ее безопасность и высокая эффективность, после чего началось ее массивное применение у нас, а затем и в большинстве стран мира. В результате плановой вакцинации ликвидированы эпидемии полиомиелита. Имеются успехи в борьбе с корью. Разработана у нас живая коревая вакцина и организованна массовая вакцинация против кори. В результате в 8-10 раз снижена заболеваемость. Получена живая вакцина против паротита. Разработано несколько вариантов живой гриппозной вакцины. На очереди разработка живых вакцин против гепатита А и краснухи.

Корпускулярные убитые вакцины. Готовят из очищенного концентрированного вируса, инактивированного формальдегидом или ультрафиолетовым облучением (менее надежный).

Достоинство этих вакцин – более точная дозировка. Недостаток – необходимость многократного введения и инъекционный путь введения (не образуется Ig A).

В нашей стране разработаны вакцины против гриппа и полиомиелита. Получена убитая вакцина против герпеса. Применяют вакцины против бешенства, полученные из мозга лабораторных животных и в культуре клеток. Вакцина против клещевого энцефалита. В стадии внедрения находится вакцина против гепатита В, полученная из HB-s – антитела.

Субъединичные вакцины содержат протективные антигены. В корпускулярных вакцинах, приготовленных из сложно устроенных вирионов, лишь 10% поверхностно расположенных белков являются специфическими. Остальные балласт, усиливающие реактогенность вакцин. Субъединичные вакцины – высокоочищенные иммуногенные препараты. Однако иммуногенность их ниже.

Синтетические вакцины – вакцины будущего, когда субъединичные вакцины коньюгируются с носителем и иммуностимулятором.

Антивирусные сыворотки получают из сыворотки крови животных, иммунизированных вирусными вакцинами или штаммами. Эти сыворотки затем очищают и выделяют α – глобулины. α – глобулины (гомологичные), получаемые из крови человека, готовят двух видов – противокоревой (или нормальный) и иммуноглобулины направленного действия.

Гомологичный α – глобулин нереактогенен и циркулирует в организме более продолжительное время. Противокоревой (или нормальный) α – глобулин получают из донорской, плацентарной или абортной крови, которая содержит антитела против вируса кори, гриппа, гепатита, полиомиелита, возбудителей коклюша.

Иммуноглобулины направленного действия готовят из сыворотки крови добровольцев, которых иммунизируют. Получают сыворотки против гриппа, бешенства, оспы, клещевого энцефалита, столбняка и стафилококковой инфекции.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций складывается из трех направлений:

1. Обнаружение возбудителей или его компонентов непосредственно в клиническом материале, взятом от больного (ускоренная диагностика).

2. Выделение вируса из клинического материала и его идентификация.

3. Серодиагностика вирусных инфекций.

Выбор метода лабораторной диагностики определяется характером заболевания и предполагаемым возбудителем и решается в каждом отдельном случае в зависимости от периода болезни и условий лаборатории.

Ускоренная (быстрая) диагностика вирусных инфекций. Быстрая диагностика позволяет обнаружить вирус или его компоненты непосредственно в пробах, взятых от больного, и дать ответ через несколько часов.

Методы ускоренной диагностики:

1. Прямое микроскопирование мазков – отпечатков с целью выявления внутриклеточных телец – включений, например, при бешенстве, герпетической инфекции, ветряной оспе.

2. С помощью флюоресцирующих антител: в клетках эпителия слизистой оболочки верхних дыхательных путей у больных респираторными инфекциями; слущенных клеток эпителия слизистой оболочки кишечника больных гастроэнтеритами; мазках – отпечатках, взятых из пораженных органов.

3. С помощью электронной микроскопии. Этот метод требует достаточно высокой концентрации в пораженной ткани. Большие концентрации вируса бывают в фекалиях лишь при энтероавирусной инфекции.

4. С помощью твердофазного иммунологического анализа. Твердофазный иммунологический анализ основан на прикреплении одного из компонентов реакции (антитела или антигена) к нерастворимому твердому носителю (панели плашка) и последовательному добавлению других компонентов реакции в жидкой фазе. В зависимости от маркера, используемого для метки антигена или антитела, реакции твердофазного анализа могут быть двух категорий: с использованием радиоактивных маркеров (РИА) и ферментов (ИФА) – пероксидаза или щелочная фосфатаза. Оба метода широко применяются для быстрой диагностики гепатита А и В, гастроэнтеритов, в первую очередь энтеротавирусных инфекций.

5. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).. Это самый совершенный метод исследования. Его использование все больше распространяется в связи с тем, что он позволяет обнаружить единичные копии генов в клеточной популяции и по степени чувствительности не имеет себе равных среди других диагностических методов. В первую очередь метод ПЦР применяют для выявления персистирующих вирусов и вирусов, находящихся в клиническом материале (крови, моче, фекалиях и т.д.), которые не размножаются в культуре клеток.

Выделение вируса из клинического материала. Это трудоемкий процесс, требующий продолжительного времени, поэтому результаты, полученные при выделении вируса, являются ретроспективными. Вирусы могут быть выделены путем заражения лабораторных животных или культур клеток и идентифицировании с помощью биологических и серологических тестов.

В настоящее время общее число систем и методов, используемых для выделения и идентификации вирусов, достаточно велико и позволяет решать эту задачу для большинства из них. Правда, такие возбудители как вирусы гепатитов А и В, до сих пор культивируются с трудом и лишь на специальных моделях. Одно следует знать, что само по себе выделение вируса из организма человека и даже больного не всегда может свидетельствовать о его этиологической роли. Только при тщательном сопоставлении с данными клиники и эпидемиологического анализа, а затем с результатами серологических реакций материала о выделении и идентификации вируса получают соответствующую оценку.

Основные методы, применяемые для выделения вирусов:

1. Лабораторные животные – белые мыши, морские свинки, кролики, куры, голуби и др. вирус гриппа у белых мышей вызывает пневмонии, вирус Коксаки у белых мышей – параличи, вирус гепатита В у шимпанзе – поражение печени.

2. Куриный эмбрион получил широкое распространение в вирусологии после работ Вудруффа и Гудпасчера (1931г.). Заражают хорион-аллантоисную оболочку, аллантоисную полость, полость амниона, желточный мешок.

Начиная с 50-х годов после открытия Эндрюсом способности вируса полиомиелита размножаться в культивируемых клетках ткани эмбриона человека, культуры клеток начали интенсивно внедрять не только в исследовательскую, но и диагностическую работу лабораторий. Метод культуры клеток требует специальных условий и не лишен недостатков. Культивирование вируса in vitro даже в первичных культурах не отражает тех сложных межклеточных и внутриорганных взаимодействий, которые существуют в организме. Возникает ситуация, когда клетки, резистентные к возбудителю в условиях организма, проявляют к нему чувствительность и наоборот. Это установлено для вируса оспы, вируса полиомиелита.

Принципам и методам применения культуры клеток посвящено большое количество специальных монографий, обзоров, методических рекомендаций (Иржанов, Хесин, Гаврилюк и Сафронов и др.).

Большую роль в вирусологических исследованиях играют перевиваемые культуры клеток, способные в течение многих лет сохранятся и размножатся при пассировании на искусственных питательных средах. Наиболее распространенные клетки человеческого происхождения: рака шейки матки – Heza, полости рта – КВ, гортани – Нер-2, костного мозга, больного раком легких – Детройт-6 и др.

Повторение

Культивирование вирусов. 1. Накопление вируса в организме животных. Вирусы могут накапливаться в слизистой ротовой полости скота, вирус бешенства - в мозге собак. Поэтому в зависимости от вида вируса заражение животных произво­дят: интранозально, интрацеребрально, в кожу, энтерально и т.д.

Однако, несмотря на многие достоинства, использования мелких лабораторных животных учёных не совсем удовлетворяло, т.к. для многих вирусов отсутствует биологическая модель. Поэтому стали вестись поиски более доступных, удобных дешёвых средств для куль­тивирования вирусов. Такой метод был найден в 1931 г. Вудрафом и Гудпасчером, которые стали первые использовать куриные эмбрионы. Но только после блестящих исследований австралийского вирусолога и иммунолога Ф.Бернета куриные эмбрионы получили широкое распрос­транение в вирусологии. Бернет издал пособие по вирусологии "Вирус, как организм". Для культивирования вирусов используются 8-12 днев­ные куриные эмбрионы. Вирусы репродуцируются в амнионе (грипп), хорионаллантоисной оболочке (грипп, оспа, герпес), в желточном мешке (бешенство, герпес). Чаще всего вирус вводят в аллантоисную и амниотическую полости и на хорионаллантоисную оболочку. Для этого при­меняется медицинский шприц.

О репродукции вируса судят по образованию на хорионаллантоисной оболочке включений, так называемых оспин (оспа, герпес), по гибели эмбриона или на основании разработанных реакций, например, по реакции гемагглютинации. Выращивание вирусов в куриных эмбрионах - это простой, удобный и довольно де­шёвый метод получения вирусной массы первичного выделения виру­сов от больных людей и животных, определения их количества (титра вируса) в исследуемом материале и пр.

Однако и этот способ не совсем устраивает учёных, стали искать более совершенные методы культивирования вирусов. Положение резко изменилось, когда изобрели способ культивирования клеток человека, животных и растений вне организма. В 1949 г. была открыта методи­ка культивирования клеток в искусственных условиях. Авторы этого открытия - американские вирусологи Дж.Эндерс, Т. Уэллер, Ф. Роббинс, которые в 1952 г. получили Нобелевскую премию за разработку метода культуры клеток. Использования культуры клеток в вирусологии явилось подлинно революционным событием, послужившим основой для выделения новых вирусов, их идентификации, клонирования, изучения их взаимодействия с клеткой. Появилась возможность получения культуральных вакцин.

Культура клеток прочно вошла в вирусологическую практику.

Наибольшее распространение получили трипсинизированные культуры эпителиальной и соединительной тканей, клетки которых в виде монослоя прикрепляются к стенкам стеклянной лабораторной посуды. В чём же суть этого метода? Сперва ткань соответствующим образом обрабатывают (удаляют плёнки, промывают и пр.), а затем измель­чают на мелкие кусочки размером, в 2-3 мм. Как известно, клетки в тканях прочно соединены друг с другом межклеточными белковыми и другими веществами. Для разрушения последних используют протеолитические ферменты (трипсин), который расщепляет белки и тем са­мым разъединяет клетки друг от друга. В результате получают взве­сь изолированных клеток. Из 1 г ткани приблизительно можно полу­чить от 50 до 100 млн. клеток. Полученную взвесь клеток подвергают центрифугированию, жидкость удаляют, а осадок разводят питательной средой, подогретой до 37, в отношении 1:5. В счётной камере подсчитывают под микроскопом число клеток в 1 мл взвеси. Это необ­ходимо, чтобы знать, какое количество нужно засевать в матрацы для культивирования. Приблизительно, должно засеваться на флакон от 50 до 400 тыс клеток. Флаконы с клетками, взвешенными в питатель­ной среде, помещают в термостат при 37°С. Клетки довольно быстро размножаются и быстро прилипают к стеклу. Через 3-5 дней на ровной стеклянной поверхности флакона образуется сплошной слой клеток. (Демонстрация)

Для роста клеток требуются специальные питательные среды: среда 199 или среда Игла. Состав этих сред сложный: аминокислоты, глюкоза, коферменты, минеральные соли и многие другие компоненты. Обязательно в питательную среду вносят сыворотку крови и буферные растворы для поддержания оптимального рН. Во избежание заражения клеток посторонней микрофлорой в среду в обязательном порядке до­бавляют различные антибиотики.

Культуры клеток, используемые в вирусологической практике, по числу жизнеспособных генераций, т.е. способности выдерживать то или иное количество пересевов, подразделяются на три типа:

а) К первичным относятся культура клеток, способные выдерживать до 5-10 пассажей. Их готовят преимущественно из эмбриональной ткани, почечной ткани эмбрионов человека и обезьян, амниона челове­ка, куриного эмбриона, эмбриона мыши, а также из почек взрослых обезьян.

б) Перевиваемые культуры получают преимущественно из опухолевых клеток одного типа, которые могут размножаться ин витро в тече­ние неограниченного срока. К таким клеткам относятся линии, веду­щие своё начало от карцином человека (Хела, Не_р-2, КВ). Клетки Хела получены от женщины - полячки, погибшей от рака шейки матки.

В) К полуперививаемым культурам относят культуры диплоидных кле­ток, которые получают из фибробластов человеческого эмбриона. Эти клетки выдерживают до 100 генераций, сохраняя диплоидный набор хромосом.

Ту или иную культуру клеток заражают вирусом, вводя взвесь его частиц во флаконы, которые затем ставят в термостат для раз­множения и накопления вируса. Большинство вирусов, размножаясь в клетках, постепенно разрушают их, и клетки дегенерируют.

Таким образом, мы познакомились с тремя основными способами культивирования вирусов. Теперь следует остановиться на способах обнаружения вирусов в исследуемом материале.

1. В 1941 г. американским вирусологом Херстом был открыт феномен гемагглютинации. Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способ­ности некоторых вирусов, вызывать агглютинацию (склеивание) эритроцитов различных видов животных и человека. При этом одни вирусы лучше агглютинируют эритроциты человека или морской сви­нки, другие - эритроциты кур, гусей и т. д. В результате этой реак­ции в пробирке образуется так называемый зонтик, который хорошо виден невоо­руженным глазом. При отсутствии вируса, эритроциты оседают на дно пробирок или лунок полистероловых пластинок, в которых ставят реа­кцию, в виде компактной "пуговицы". (Демонстрация рисунка РГА).

2. В культуре клеток репродуцирующие вирусы могут быть выявлены реакцией гемадсорбцией (РГ_адс), представляющей собой вариант реакции гемагглютинации. Суть этой реакции заключается в том, что клетки, пораженные вирусом, приобретают способность адсорбировать эритроциты, т.к. вирусы после репродукции выходят на поверхность клеток. Следует заметить, что обе эти реакции не являются иммунологическими, поскольку они протекают без участия антител.

3. В заражённых культурах клеток большинство вирусов при внутри­клеточной репродукции вызывают цитопатическое действие (ЦПД). Цитопатический эффект выражается в различных изменениях морфоло­гии клеток: пикнозе ядер, формировании многоядерных клеток, так на­зываемых симсластов, или синцитиев, образующиеся в результате сли­яния клеток, а финалом нерёдко бывает полная деструкция монослоя. Одним словом, многие вирусы, размножаясь в клетках, постепенно разрушают их и клетки дегенерируют, дегенеративные изменения клеток хорошо видны под микроскопом.

4. О репродукции вируса в культуре клеток; можно судить и по цветной пробе. Цветная проба основана на том факте, что обычно клет­ки культуры ткани, при своём росте изменяют рН питательной среды за счёт выделения кислых продуктов метаболизма. Это определяется по изменению рН питательной среды с помощью индикатора, фенолового красного, который в кислой среде меняет свой цвет на жёлтый. Так бывает в отсутствие вируса. При заражении культуры клеток вирусов клетки гибнут, рН в кислую сторону не меняется, при этом сохраняется первоначальный цвет среды.

В заключение этого раздела хочу подчеркнуть, что с помощью разнообранных способов можно только обнаружить вирусы в материале, что называется индикацией, но нельзя установить их видовую принадлежность. Для определения же вида вируса, а это называется идентификацией, применяются другие реакции, в которых используют­ся специфические, заведомо известные антитела. Это так называемые иммунологические исследования, но данные вопросы будут рассмотрены в отдельной лекции по иммунологии.

Серологические методы. Серологические методы это комплекс реакций по обнаружению и идентификации вирусов или антител в различных биосубстратах или средах.

Наиболее распространенная – реакция нейтрализации. Выявляет антиген и антитела в парных сыворотках.

Среди серологических тестов, используемых в работе вирусологических лабораторий, значительное место занимают реакции, основанные на принципе гемадсорбции.

Применяют: реакцию гемагглютинации (РГА) – прямая гемагглютинация в основе которой лежит непосредственное действие вируса на эритроциты;

РТГА – реакция торможения гемагглютинации, реакция пассивной или не прямой гемагглютинации РПГА или РНГА;

РСК – реакция связывания комплимента;

ИФА – иммуноферментный метод;

МФА – метод флуоресцирующих антител;

РИМ – радиоиммуный метод;

Лабораторные методы исследования вирусов должны продуманно увязываться с клиническими и эпидемиологическими данными.