3 Бөлім. Суспензия өсіндісі және иммобилизацияланған ферменттер және биокатализдік жұйелер

3.1 Суспензия өсінділерінде зат алмасудың екінші реттік метаболиттерінің өнімі

 

а) Ферментёрлерде көп мөлшерде суспензия өсіндісін өсіру тәсілдері.

б) Суспензия өсінділерінде зат алмасудың екінші реттік өнімдерінің пайда болуы.

          Каллус ұлпасын өсіру үшін екі тәсілді қолданады: тығыз ортада және сұйық ортада, яғни терең қабатта өсіру. Бірінші тәсіл алғашқы каллус ұлпасын алу үшін және өсімдікті өз қалпына келтіру үшін қолданады. Екінші тәсілді – сұйық ортада өсіру, көбінесе өнеркәсіп технологиясында, биохимиялық және физиологиялық зерттеулерде, пайдалы екінші зат алмасу метаболиттерін алуда және жасуша селекциясында  қолданылады. Бұл тәсіл бойынша жеке жасушаларды немесе олардың шағын бөлшектерін сұйық ортада үнемі араластырып, ауамен толықтырылып отыратын жағдайда өсіреді.Каллус ұлпасынан суспензия өсіндісін алу. 2-3 г борпылдақ каллусты 60-100 мл араласып тұратын сұйық ортаға көшіргенде, суспензия өсіндісі алынады. Одан кейін колбаны жылдамдығы  минутына 100-150 айналымы бар айналғышқа орналастырады. Каллус ұлпасын жеке жасушаларға бөлшектеу  және  жақсы өсетін суспензия пайда болу үшін алғашқы ұлпасын 2,4–D қосылған Са⁺ иондарсыз ортада өсіреді, сондай-ақ тасымалдау алдында пектиназа ферментімен өңдеу қажет.  Содан кейін алынған алғашқы сұйық ортаны 1-2 қабат сүзгі арқылы өткізіп,  каллус ұлпасының ірі бөлшектерінен бөліп алады.

Суспензия өсіндісін тікелей өсімдіктің мүшелерінен түйнектерден, картоп түйнегінен, сәбіздің қор үлпершегінен де алуға болады. Бірақ бұндай жол қиындау және көп уақытты талап етеді. Эксплант жасушалары алғашқы каллус түзуге тиісті, содан кейін ғана сұйық ортаға түсіп, көбейген каллус жасушалары сұйық ортада өсе  алатын жаңа линияны бастайды.

Жасушаның әрбір линиясы үшін инокулюмның келесі ортаға   көшірілетін суспензия өсіндісінің бөлімі ең аз мөлшері алынады. Инокулюмның мөлшері азайған сайын, лаг-фазаның ұзақтығы ұлғая түседі. Сұйық ортада өсетін жасушаны жүйелі түрде жаңа қоректік ортаға жиі көшіріп отыру қажет,  өйткені еріген қоректік заттарға бай сұйық ортада жасуша барлық жағынан толық қамтамасыз етіліп, жасушалары тез бөлініп, өсуі де жылдамырақ болады. Жақсы сұйық ортада өсетін жасуша линияларының саны 5-10 жасушадан көп болмауы керек. Морфологиялық жағынан жасушалар (мөлшерлері кішірек, цитоплазмасы тығыз, пішіні жұмыртқа тәрізді) біркелкі болады.

Ферментёрлерде көп мөлшерде суспензия өсіндісін өсіру тәсілдері.

Суспензия өсіндісін өсіргенде екі негізгі тәсілді қолданады:

 1) суспензия өсіндісін ферментёрлерде көп мөлшерде жылдам өсіру;

 2) алдын ала иммобилденген бекітілген жасушаларды өсіру және оларды ұзақ уақыт бойы екінші зат алмасу өнімдерін алуда пайдалану.

Өсімдік жасушаларын сұйық ортада өсіру кезінде бактериялар мен саңырауқұлақтарға арналған  микробиология тәсілдерін қолданады. Ол үшін мерзімді немесе ағынды тәртіптегі ашық немесе жабық жүйелерді пайдаланады. Мерзімді тәртіптегі жабық жүйеде жасуша массасын инокулюмды белгілі мөлшердегі қоректік орта құиылған ферментёрлерге орналастырады, онда аз ғана лаг - кезеңінен кейін жасушалар алдымен біртіндеп ұлғаяды, содан соң бір қалыпты жылдамдықпен бөліне бастайды. Қоректік ортаның біртіндеп таусылуына, зиянды  заттардың  көбеюіне байланысты  өсімдік жасушасының өсуі тоқталады. Осымен өсіру кезеңі аяқталып, суспензияның бір бөлігі, яғни инокулюм, жаңа қоректік ортаға ауыстырылады. Осылайша жаңа үрдіс басталады. Бұл жүйенің көрсеткіштері тұйық болады, тек  пайда болған  газдар сыртқа шығарылып отырады.

Үздіксіз тұйық жүйеге мезгіл сайын жаңа қоректік  орта жіберіліп тұрады, ескісі сол мөлшерде шығарылады. Жасушалар бұл жүйеде өсіру уақыты бойынша тіршілік етеді. Қоректік орта жаңарып тұру арқасында өсіру кезеңі ұзарып, жасушаның қынды бөліну кезеңі ұлғаяды, соған байланысты алынатын өнімнің саны артады.

Ашық ағынды жүйеге мезгіл сайын немесе үздіксіз жаңа қоректік орта құйылып, ескі ортамен бірге жасуша массасының бір  бөлігі алынады. Жасуша популяциясы белгіленген тығыздыққа дейін жеткізіліп шығарылады.

Мезгіл сайын жаңартылатын, мерзімді жабық жүйе толық зерттелген және кең таралған.

Жасуша өз  мамандығынан айырылып, бөліне бастағаннан кейін  зат алмасудың екінші реттік метаболиттері түзіледі. Оларға алкалоидтер, терпеноидтер, полифенол, полисахаридтер, эфир майлары, глюкозидтер  тағы басқа заттар жатады. Каллус ұлпаларының метаболиттерді түзу қабілетін жоғалтпайтындығы анықталған соң, оларды экономикалық құнды заттар өндірісінде пайдалана бастады. Әдетте, олардың көзі ретінде мәдени және жабайы өсімдіктерді қолданады, көбінесе шалғай аудандарда өсетін, яғни басқа географиялық аймақтар мен экологиялық жағдайларда жерсіндіруі қиындыққа соғатын өсімдіктерді. Қалыптасқан  тәсілдермен салыстырғанда жасуша өсірудің артықшылығы - бағалы шикізатты өсімдіктің таралу аймағына, ауа райына, маусымға, топырақ жағдайларына, өсімдік ауруларына қарамастан алуға болады. Табиғи шикізат қорларының азаюына байланысты мәдени мен жабайы өсімдіктердің орнына жасуша биомассасын өндіріс тәсілімен кепілді өсіруге болады.

Өсімдіктерде зат алмасудың екінші реттік өнімдерінің алкалоид, гликозид, полифенол, полисахаридтер, терпеноидтер, терпендер, эфир майлары, стероидтер, табиғи бояулар, инсектицидтер жаңа ерекше қосылыстары: антиканцерогендер – камптотецин мен харрингтонин, пептидтер – протеаза ингибиторлары, вирус ингибиторлары, жаңа табиғи бояулары анықталды.

Жасуша өсіндісінен мынадай метаболиттерді алған өте тиімді: аймалицин жүрек ырғақсыздығына қарсы зат, резерпин, серпентинді – жылан раувольфиясынан (Rauwolfia serpentina)морфин мен папаверинді-көкнәрден (Papaver sommniferum); никотин, анабазин, тестостерон және убихинонды темекіден (Nicotiana tabacum); диосгенин мен стероидті - сапонинді дельта тәріздес диоскореядан (Dioscorea deltoidea); сондай–ақ, винбластин, виндолин және катарантин - катарантустан (Catarantus roseus); атропин мен скополамин тропаннан ментол - жалбыздан (Mentha); дигитоксин мен дигоксинө дигиталистан, диктамин - рутадан (Ruta graveolens); хинин - хин ағашынан (Cinchona ); сергітетін заттар женьшень (Panax ginseng) тамырынан алынады.

Ресейде женьшень биомассасын өсіретін өндіріс дамыған. Женьшеньнің 0,1г эксплантынан 1,5 айдың ішінде 5г немесе 1л ортадан 1 жылда 13 кг ұлпа массасын алуға болады. Қолайлы жағдайдың өзінде плантацияда тамырдың орташа өсуі  жылда 8 г екендігін ескерсек, бұл өндіріс өте тиімді. Тағы бір айтып кететін жағдай, каллустан алынған экстрактың сапасы табиғи өсетін женьшень тамырынан алынған экстрактының сапасымен бірдей.

Жапонияда темекіден убихинонды және торғайшөптен (Lithospermum) шиконинді алу мақсатында жасуша массасын өсіру өндіріс жолына қойылған. Жапонияда басқа  өсімдіктердің жоғары өнімді жасуша линияларынан алынатын өндіріс дамыған.

         Ресейдің өсімдіктер физиологиясы ғылыми-зерттеу институтында жылан раувольфиясының жасуша линияларынан мутанттар алынды, олар медицинада жүрек ырғақсыздығын емдеу үшін өте қажетті алкалоид – аймалинді 10 есе көп шығаруға мүмкіндік береді. Хош иісті рута өсімдігі жасушаларынан жоғары тиімді штамдар алынды, олардан алкалоид рутакридон түзіледі, бұл заттар гормональдық препараттарды дайындау үшін қажет. Қазіргі кезде көптеген мемлекеттер ұлпа өсіндісінде өсімдіктердің сан алуан түрлерін қолданады.

Мысалы, агава (Agave), тісті амми (Ammi visnaga), беладонник (Atropa bellaөdonna), мамыр інжугүлі (Convallaria magalarisL.), кәдімгі меңдуана, дельта тәріздес диоскорея (Dioscorea deltoidea), женьшень (Panax ginseng), темекі (Nicotiana tabacum), жылан раувольфиясы (Rauwolfia serpentina), майкене ( Risinus), катарантус (Catarantus roseus) және т.б. өсімдіктер өсіндісінде алынатын гликозидтер топырақта өсетін өсімдіктердің гликозидтерінен айтарлықтай артық екендігі анықталды.                                                                     

 

3.2 Иммобилизацияланған ферменттер және биокатализдік жүйелер

 

а) Жасушаның иммобилизацияланған жүйелерін алу   кезеңдері.

б) Қазіргі кезде ферменттерді, жасушаларды және органеллаларды иммобилизациялаудың ортақ тәсілдері.

Өсімдік жасушасын сұйық ортада көп мөлшерде өсірудің кемшіліктері бар: өте баяу өсуі (мысалы, қалыпты жағдайға келу үшін бір ай уақыт керек), ыдыс қабырғасына биомассалардың жабысуы, нашар араласуы, түйірленіп қалуы және биореакторда гетерогендік аймақтардың пайда болуы жасуша өсіру үшін қиындық туғызады. Сондықтан екінші реттік метаболизм заттарын түзу үшін иммобилизацияланған  жасушаларды қолдану тиімдірек болады. Оның себептері мынадай:

а/ ферментёрде жасушаларды сақтау арқылы және екінші реттік метаболизм заттарын ортадан бөліп алу жолымен биомассаны бірнеше рет пайдалануға болады

ә/ ортадан жасушаны бөліп алуға болады

б/ қымбат ферменттёрді тиімді пайдалануға мүмкіндік береді шағын көлемді ыдыста биомассаны көп мөлшерде өсіру

в/ ұзақ уақыт бойы өсіру құбылысын пайдалануға болады.

Жасушаның иммобилизацияланған жүйелерін алу үшін мынадай кезеңдерден өту керек:

1.   Алдын ала белгіленген қасиеттері бар, мысалы өсу жылдамдығы баяу жасуша өсіндісі, бірақ өнім шығымы жоғары жасуша линиясын алу.

2.   Иммобилизацияланған жасушаларды өсіру және жасушаның тіршілігін жоймау үшін тиісті тәсілмен бірге ыдыс геометриясын таңдау қажет.

3.   Жасушадан қоректік ортаға метаболиттердің бөлініп шығуына және өсімдік тіршілігінің жойылмауына жағдай туғызу.

Қазіргі кезде ферменттерді, жасушаларды және органеллаларды иммобилизациялаудың ортақ тәсілдері бар.

 Адсорбция немесе химиялық тігу жолымен  иммобилизациялау.  Биообъект бейорганикалық /силикагель, құм, күйіктас, кеуекті шыны/ және органикалық /целлюлоза, хитин, нейлон, полиэтилен, полистирол, шайыр заттардың бетіне бекітіледі. Заттар мен олардың бетінде орналасқан объекті арасындағы  байланыстарының механизмдері, беріктігі әр түрлі болады.  Көбінесе биомассаны сіңіріп алатын ірі кеуекті синтетикалық материалды, “губкаларды”  қолданады. Кеуекті материал ретінде ашық ұялы қатты көбік түзетін кең таралған полиуретан алынады. Осы материалды ұсақтап, биореакторға жасушамен бірге орналастырады. Жасушалар материалдың ұяларына кіріп, жылдам өсе бастайды.

Полимерлік құрылымға енгізу арқылы иммобилизациялау.

Биокатализаторды полимерлік құрылымға кіргізеді, соның арқасында жасуша немесе ферменттер орналасқан гранулалар, пленкалар, талшықтар пайда болады. Бұл жағдайда жасушалар      өзінің катализдік белсенділігі мен тіршілікке икемділігін сақтап қалады және көп кезеңді полиферменттік реакцияны жүргізе алады. Қолдануға болатын табиғи және синтетикалық полимерлік материалдар: альгинат, каррагинан, коллаген, желатин, целлюлоза, хитин, полиакриламид.

Полимерлік құрылымға биологиялық материал қосу тәсілі полимердің түріне байланысты. Теңіз балдырынан алынатын альгинат және каррагинин полимеризациясы /альгинат үшін/ Са²⁺және /каррагинан үшін/ Al³⁺, Mo²⁺, Fe³⁺, K⁺, NH₄⁺ иондарына тәуелді болады. Биообъектіні альгинат /каррагинан/ мономері ерітіндісіне қосады, одан кейін қосындыны тамшылатып тиісті катионы бар су ерітіндісіне қосады. Нәтижесінде иммобилизацияланған  /бекітілген/ жасушалар және сфералық полимердің бөлшектері пайда болады.

 Инкапсула арқылы иммобилизациялау

Бұл тәсіл бойынша биокатализаторларды арнайы жартылай өткізгіш мембранамен қаптайды. Оларды дайындау үшін целлюлоза, полиакрилат, полистерол, полиуретан, поликарбонат, полилипидтерді қолданады. Инкапсульдеудің бір мысалын қарастырайық. Жасушалар альгинат тамшыларына енгізіледі, олардан Са²⁺ ионы әсерінен гранула түзіледі. Осы гранулаларды жартылай өткізгіш мембранамен қаптайды. Одан кейін Са²⁺ ионын бөліп алады. Альгинаттың полимерлік құрылымы мономерлерге бөлінеді. Жасушалар уылдырық ішіндегі шабақтар тәрізді капсула ішінде еркін қозғала алады, соның нәтижесінде олар өсіп, қоректенеді. Мембрана саңылауларының мөлшерін оларда керек заттар тұрып қалатындай, ал төмен молекулалық қосылыстар шайылып кететіндей есептеп, реттейді. Түзілу құбылысы біткен соң, керек емес қосылыстардан тазартылған капсулаларды гомогенизаторда ұсақтап центрифугалау арқылы ерітіндіден оңай бөлінетін  өнім алынады. Осы иммобилизациялау тәсілдерінің барлығы  қарапайым әрі арзан, жасушаның тіршілігіне зиян келтірмейді.

Көлденең тігу арқылы иммобилизациялау

Әдетте, бұл тәсіл жасуша тіршілігінің жойылуымен байланысты. Ол үшін глутар альдегид немесе басқа кіші молекулалық агент жасушаның ішіне сіңдіреді де, оның органеллалары, фермент молекулалары және басқа жасушалардың ферменттері арасына тігістер жасайды. Бұндай өңдеу кезінде жасуша тіршілігі жойылғанымен, ферменттер жүйесінің белсенділігі арта түседі.

Биотрансформация

Сұйық ортада өсірілетін жасушаларды мультифермент жүйелері ретінде қолдануға болады, олар химиялық заттарды биотрансформациялайды. Осындай жасушалардың белсенді ферменттері табиғи немесе синтетикалық өнімнен одан да бағалы заттарды алу үшін пайдаланады. Биотрансформацияны биологиялық белсенді бірегей заттарды алу үшін де қолдануға болады.

Биотрансформация жасуша компоненттері көмегімен екі түрде өтеді:

а/ бүтін жасушаларды сыртқы қондырма үстіне бекіту жолымен иммобилизациялау немесе бос сұйық орта түрінде пайдалану керек

ә/ жасушаның иммобилизацияланған құрам бөліктерінің препаратын қолдану арқылы.