1.6. Біохімія метанового бродіння

Процес метанового бродіння вивчався спочатку без зв'язку його з енергетикою. В результаті при вивченні механізму утворення метану дослідники прийшли до висновку про те, що хімізм утворення метану — це енергетичний процес, що забезпечує утворення АТФ, який використовується збудниками метанового бродіння. Оскільки до цього часу були відомі конкретні механізми енергетичних процесів, зокрема їх зв'язок з переносом водню і електронів, виникло припущення, що джерелом енергії при метановому бродінні є процес відновлення речовин воднем в метан, тобто перенос водню. Це відповідає загальнобіологічним уявленням про енергетичний обмін. Проте виникають питання, які речовини є акцепторами водню, які його джерела та шляхи переносу? Виявилось, що все це важко пояснити на основі тих уявлень, які склались спочатку відносно фізіології живлення метаноутворюючих бактерій, згідно з якими, “істинне” метанове бродіння — це перетворення нижчих жирних кислот і СО₂ в метан. Причому з нижчих жирних кислот головну роль відіграє оцтова кислота, оскільки вона найбільш вірогідний продукт анаеробного окиснення органічних речовин.

Однак просте відновлення жирних кислот дає відповідні вуглеводні. У такому випадку у метан може перетворитись лише мурашина кислота, але вона в процесі метаболізму утворюється у малій кількості. У свою чергу, з оцтової кислоти повинен утворюватись етан, однак цей вуглеводень майже не присутній у складі газоподібних продуктів метанового бродіння.

Дослідники прийшли до висновку, що оцтова кислота у ході метанового бродіння піддається не відновленню, а розпаду, причому вуглекислий газ і метильна група, що утворюються своїми шляхами перетворюються в метан. Ці шляхи сходяться, так як відновлення метильної групи — це одна з останніх стадій хімізму відновлення вуглекислого газу в метан. У наш час вже не багато дослідників притримуються думки, що метаноутворюючі бактерії споживають тільки нижчі жирні кислоти і СО₂. Проте хімізм утворення метану досі пов'язують з нижчими жирними кислотами, так що його не можна пояснити з точки зору енергетики. Згідно з існуючою думкою, утворення і відновлення СО₂ йде за схемою:

Рис. 1.6. Схема утворення і відновлення СО₂ при метановому бродінні.

При цьому всі проміжні продукти знаходяться у вигляді радикалів, пов'язаних з переносниками (тетрагідрофолієвою кислотою, коферментом, що містить вітамін В₁₂, та ін.). У чистому вигляді вказані проміжні метаболіти (як це для спрощення показано на схемі) не виявляються.

У реальності схеми відновлення СО₂ в метан не може бути сумніву, хоча це не виключає інші можливості утворення метану, подібно тому, як H₂S або NH₃ утворюються не тільки у результаті редукції сульфатів і нітратів, але і при розкладі амінокислот або інших речовин. Протиріччя у наведеній схемі виникає у відношенні джерел активного водню. У наведеній схемі таких джерел знайти не можна. Нижчі жирні кислоти є кінцевими продуктами анаеробного метаболізму саме тому, що не можуть піддаватись подальшому окисненню, тобто бути джерелом активного водню. Робилися спроби показати, що відновлення СО₂ проходить молекулярним воднем, що виділяється при окисненні білків, амінокислот, вуглеводів та інших речовин супутніми мікроорганізмами (вважаючи, що метаноутворюючі бактерії не здатні до розкладу цих речовин). При цьому передбачається, що метаноутворюючі бактерії, маючи здатність виробляти фермент гідрогеназу, використовують для відновлення СО₂ водень ендогенного походження.

Проте надзвичайно висока енергія розщеплення молекулярного водню, відома в хімії як енергія дисоціації водню, є непрямим свідоцтвом того, що такий механізм утворення активного водню в анаеробних умовах маловірогідний. Інша справа — вилучення атомарного водню з яких-небудь речовин, де він знаходиться в менш міцному хімічному зв'язку.

У хімії таким прикладом є вилучення водню дією кислоти на метал. У момент виділення водень знаходиться в активній формі. У біологічній хімії аналогічну активацію водню органічних речовин здійснюють дегідрогенази. Біологічно активний водень — НАД·Н₂ — це свого роду форма “in statu nascendi”, отримувана в хімії витісненням з кислот металами і використовувана на відновні реакції. Дегідрогенази тут виконують роль стабілізаторів, що перешкоджають швидкому сполученню атомарного водню в неактивну молекулярну форму. Продовжуючи цю аналогію, можна сказати, що у живому організмі, як і в хімії, такий шлях вилучення активного водню значно легше ніж, ніж дисоціація молекулярного водню за допомогою гідрогенази. Однак, приймаючи це, потрібно визнати, що метаноутворюючі бактерії, вилучаючи активний водень, окиснюють різноманітні органічні речовини, тобто здійснюють звичайне гетеротрофне живлення, причому споживання нижчих жирних кислот для них не обов'язкове. Відносно активації молекулярного водню метанутворюючими бактеріями, то експериментально це підтвердити не вдається. Крім того, це суперечить переконанню тих же авторів про те, що метанове бродіння може проходити на середовищі, що містить тільки нижчі жирні кислоти, коли виділення молекулярного водню взагалі неможливе.

Всі протиріччя легко вирішуються, якщо уявити, що процес розкладу речовин з утворенням СО₂ і активного водню, а потім утворення метану здійснюють одні й ті ж мікроорганізми, причому вихідними речовинами є не нижчі жирні кислоти, а білки, амінокислоти, вуглеводи та інші сполуки з високим енергетичним потенціалом. Тому слід визнати, що метанутворюючі бактерії споживають будь-які речовини. Для заперечення цього зараз вже майже немає підстав.

При такому уявленні про хімізм утворення метану напрошується порівняння його з процесом відновлення сульфатів та нітратів. Про це ще в 1936р. згадував відомий американський дослідник метанового бродіння Г. Баркер, однак відносно джерел водню, необхідного для цього процесу, він притримувався іншої думки.

Питання про вихідний стан СО₂, що піддається відновленню, також потребує уточнення. По аналогії з редукцією сульфатів і нітратів, у процесі утворення метану відбувається перенос водню на кисень СО₂. Однак, чи можливе акцептування водню молекулою вуглекислого газу, що знаходиться у недисоційованій формі? Швидше всього, для цього необхідні карбонат-йони, тобто вугільна кислота, що утворюється при хімічній взаємодії СО₂ з водою:

СО₂ + Н₂О → Н₂СО₃ → СО₃⁺² + 2Н⁺.

Такому висновку, здавалося б, суперечать відомі дані, що СО₂ слабко взаємодіє з водою і знаходиться у ній в основному просто у розчиненому вигляді. Однак так буває у чистому вигляді. У складному середовищі, де присутні різні речовини, у тому числі і мінеральні сполуки, певна кількість хімічно зв'язаного СО₂, тобто вугільної кислоти, знаходиться у вигляді карбонатів. Вони дисоціюють, утворюючи карбонат-йони, які відновлюються в метан. По мірі їх відновлення, тобто зникнення з середовища, відбувається поповнення кількості зв'язаного СО₂, відновлюється рівновага, і кількість карбонатів у середовищі стабільне і достатнє для утворення метану. Іншими словами, у процесі метанового бродіння у середовищі постійно підтримується певний рівень концентрації карбонатів, що забезпечує безперервне перетворення СО₂ в метан. Слід врахувати, що в середовищі складного складу є і інші можливості зв'язування СО₂, наприклад взаємодія з аміногрупами амінокислот і білків, з гідроксильними групами органічних сполук і т. д. Можливо, такі форми зв'язаного СО₂, подібно карбонатам, дисоціюють і відновлюються в метан.

Процес утворення метану із СО₂ можна представити як процес редукції карбонатів:

Рис. 1.7. Утворення метану із СО₂ представлене як процес редукції карбонатів.

Символом RH₂ в схемі позначені будь-які речовини, що здатні окиснюватись (відщеплювати водень) в анаеробних умовах.

Запропонована схема відрізняється від попередньої тим, що окиснюваним субстратом можуть бути будь-які речовини, і їх окиснення є одночасно джерелом СО₂ і активного водню, за допомогою якого відбувається відновлення СО₂ в метан. Все це здійснюють одні і ті ж мікроорганізми. Процес переносу водню на кисень вони використовують у якості джерела енергії. Відносно нижчих жирних кислот, зокрема оцтової, яка неминуче утворюється в анаеробному процесі, можна сказати, що метанутворюючі бактерії вилучають енергію до її утворення, а не з неї.

Слід відзначити, що при розгляді хімізму утворення метану виникає питання не тільки про джерела активного водню. Враховуючи відсутність яких-небудь даних відносно джерел СО₂, може здатися само собою зрозумілим, що його виділяється достатньо в процесі декарбоксилювання речовин, що споживаються. Анаеробне зброджування вуглеводів, як відомо, супроводжується декарбоксилюванням піровиноградної кислоти. Зброджування тих амінокислот, перетворення яких йде через стадію декарбоксилювання піровиноградної кислоти, також супроводжується утворенням СО₂. Процес декарбоксилювання відбувається і в багатьох інших випадках, не пов'язаних з утворенням піровиноградної кислоти. По іншому стоїть питання у тому випадку, коли відомі схеми розкладу речовин не передбачають утворення СО₂. При розкладі вищих жирних кислот, наприклад, це не повинно відбуватись, якщо врахувати, що основний шлях їх розкладу — β-окиснення. Між тим метан утворюється при зброджуванні будь-якого субстрату і більше всього при розкладі саме вищих жирних кислот. Як же у цьому випадку пояснити хімізм метаногенезу? Цілком очевидно, що у всіх випадках, незалежно від того, яка речовина є субстратом, що споживається, повинно бути джерело СО₂. Складність відповіді на дане питання полягає, вірогідно, у тому, що механізм анаеробного розкладу речовин до цих пір остаточно не вивчений, у той час як аеробні процеси вивчені у всіх подробицях. Прийнято вважати, що анаеробний розклад речовин здійснюється тими ж шляхами, але враховуючи відсутність кисню воно йде не до кінця. До якої саме стадії — ми добре знаємо у випадку розкладу вуглеводів. В організмі людини і тварин анаеробний розклад вуглеводів закінчується утворенням молочної кислоти, у мікроорганізмів — утворенням різноманітних органічних кислот, спиртів, альдегідів, кетонів і т. д.

Питання про анаеробне перетворення інших речовин до цих пір особливо не цікавило. Є підстави вважати, що хімізм перетворення речовин до циклу трикарбонових кислот у всіх випадках один і той самий. Цей хімізм добре відомий. Залишається встановити, на якій проміжній стадії перетворення речовин при метановому бродінні відбувається утворення СО₂ і наступне відновлення його в метан. Такий проміжний продукт, безсумнівно, повинен бути загальним для хімізму розкладу всіх речовин. Одним з центральних метаболітів у всіх випадках, як відомо, є піровиноградна кислота. Однак розклад речовин не завжди супроводжується її утворенням. Більш загальним проміжним метаболітом є ацетил-КоА. Аеробний розклад вуглеводів, вищих жирних кислот і багатьох амінокислот проходить стадію ацетил-КоА, який піддається подальшому окисненню у циклі трикарбонових кислот. Ряд амінокислот вступає у цикл через піровиноградну кислоту, як наслідок, їх розклад проходить і стадію ацетил-КоА. Деякі амінокислоти залучаються в цикл через дикарбонові кислоти, у цьому випадку також є можливість перетворення їх в ацетил-КоА. Таким чином, можна сказати, що універсальним проміжним продуктом перетворення всіх без виключення речовин є ацетил-КоА. Виходячи з цього можна розглянути можливість забезпечення метанутворюючих бактерій конструктивним і енергетичним матеріалом. У присутності кисню, як відомо, ацетил-КоА піддається циклічному окисненню, що забезпечує всі потреби метаболізму. При метановому бродінні циклічне окиснення відсутнє, і процес розкладу речовин, доходячи до стадії ацетил-КоА, завершується його перетворенням у який-небудь кінцевий продукт, як це відбувається при інших бродіннях. При цьому виникає питання, у що перетворюється ацетил-КоА і як у цьому випадку мікроорганізми забезпечують свої енергетичні і конструктивні потреби.

З агальновідомо, що наявності ацетил-КоА, його здатності перетворюватись у піровиноградну кислоту та інші метаболіти достатньо для забезпечення конструктивних потреб організму. Відносно енергії, то для її вилучення метанутворюючим бактеріям необхідний СО₂. Це дає можливість редукції карбонатів і утворення метану при розкладі будь-яких речовин. Виходячи з цього можна припустити, що завершення процесу перетворення речовин на стадії ацетил-КоА відбувається за схемою:

Рис. 1.8. Схема завершення процесу перетворення речовин на стадії ацетил-КоА.

Ця схема аналогічна відомій схемі перетворення оцтової кислоти, запропонованої ще на початку вивчення хімізму утворення метану: