Антитіла широко застосовуються з діагностичною метою в медицині: на принципі реакції антиген-антитіло засновані методи іммуносцинтіграфії, імуногістохімії, вестерн-блоту тощо.

Для очищення і стандартизації поліклональних| антитіл використовується афінна| хроматографія. Сироватка крові від імунізованої тварини пропускається через колонку з|із| полісахаридними| кульками, до яких ковалентно| пришитий антиген. Специфічні антитіла зв'язуються антигеном, всі інші білки, і зокрема антитіла з|із| низькою спорідненістю до антигена, провалюються через колонку, услід за цим специфічно зв'язані антитіла змивають з колонки кислим або лужним розчином: зв'язок антигена з|із| антитілом нековалентна|. Один цикл афінної| хроматографії дозволяє очистити білки в 1000 разів і більш.

Проте|однак| навіть такий спосіб очищення не дозволяє повністю позбавитися від гетерогенності препарату антитіл. Вихід з|із| цього утруднення|скрута| — в отриманні|здобуття| антитіл з|із| однією специфічністю, що реагують з|із| єдиною антигенною детермінантою|. Такі антитіла називаються моноклональними (див. [3]). Їх отримують|одержувати| методами клітинної|клітковий| інженерії шляхом гібридизації імуннокомпетентних| B-лімфоцитів і кліток|клітина| мієломних пухлин, здібних до швидкого розмноження, необмеженого числом ділень|поділка,розподіл,поділ| (на відміну від більшості не пухлинних кліток|клітина|, у|в,біля| яких число ділень|поділка,розподіл,поділ| обмежене). Препарати моноклональних антитіл характеризуються постійністю|незмінність| складу і фізико-хімічних|фізико-хімічний| властивостей, низькою вірогідністю|ймовірність| перехресної реакції з|із| "чужими" антигенами. Це високотехнологічний продукт. Його недолік|нестача| — часто|частенько| порівняльна низька спорідненість до субстрата, низька афінність|.

4. Ферменти як мітки в іфа

Необхідно підібрати|добрати| такий фермент, який тривало зберігає свою активність, не втрачає|розгублювати| її при операції пов'язання|зв'язування| з антигеном або антитілом, володіє високою специфічністю до субстрата. Широко використовуються пероксидаза| хріну, лужна фосфатаза і |3-галактозидаза Escherichia coli. Перспективні люциферази| світляків|світлячок| і що світяться цими|сей| бактеріями. Активність ферментів детектують по зміні оптичної щільності, флуориметричності| і електрохімічності. Люциферазні реакції супроводжуються|супроводитися| висвіченням фотонів, тому їх реєструють по біолюмінесценції. Декілька прикладів|зразок|.

4.1 Каталіз реакції |пероксидазою

Як AH2 можуть бути різні з'єднання|сполучення,сполука|. Так, відновлений безбарвний|безколірний| офенилендіамін| в пероксидазній реакції перетворюється на окислену|окислювану| забарвлену|пофарбований| форму з|із| максимумом оптичного поглинання при 435 нм|, що реєструється фотометрично.

Лужна фосфатаза каталізує гідроліз фосфорних ефірів: 4-нітрофенілфосфат перетворюється на 4-нітрофенол, що реєструється по оптичній щільності при 405 нм|; 4-метилумбеліферилфосфат перетворюється на 4-метилумбеліферон, що флуоресціює з|із| високим квантовим виходом при 450 нм| (флуоресценцію порушують|збуджувати| при 365 нм|).

3-Галактозидаза каталізує гідроліз лактози з|із| утворенням глюкози і галактози|. Якщо замість природного субстрата узяти 4-метилумбеліферил-P-D-галактозід, при гідролізі утворюються галактоза| і 4-метилумбеліферон, реєстрований флуориметрично|.

У люциферазних| реакціях детектують біолюмінесценцію:

Якщо пряму взаємодію реалізувати не вдається, в хід йдуть біфункціональні зшиваючі агенти: глутаровий| диальдегід|, п-бензохинон|. Функціональні групи реагентів можуть бути активовані. Так, гідроксигрупи| у вуглеводному компоненті пероксидази| хріну можна окислити|окислювати| за допомогою періодата| натрію до альдегідних, через які потім пришиваються антиген або антитіло за участю аміногруп з|із| утворенням підстави|основа,заснування| Шиффа: E-CH=N+H-Аг

Вітамін біотваней виключно|винятково| міцно зв'язується з|із| яєчним білком авідином| — інгібітором біотин вкючаючих| ферментів: константа скріплення|зв'язування| в реакції авідин| (А) + біотваней (Б) —- комплекс АБ|, визначена з|із| рівняння Kf= [АБ|]/[А] [Б], складає ~10¹⁵ М"1. Якщо приготувати комплекси Аг-біотін і авідин-E і потім|і тоді| змішати їх, то утворюється комплекс Аг-біотин-авідин-E.

Імунологічні методи отримання|здобуття| антигенів або антитіл, що мітяться|цілитися| ферментами, засновані на застосуванні|вживання| антитіл або їх складових, як зшиваючі ланки. Антитіла всіх п'яти класів побудовані|споруджені| по єдиному плану. На мал. 1 показані імуноглобуліни класу G. Антитіло побудоване|споруджене| з|із| чотирьох поліпептидних| ланцюгів|цеп|: два важких|тяжкий| (H від англ|. heavy — важкий|тяжкий|) і два легких (L від light — легкий) з|із| молекулярними масами відповідно|відповідно до| 50 і 25 кДа|. Важкі|тяжкий| ланцюги|цеп| пов'язані один з одним двома дисульфідними| зв'язками через залишки цистеїну. Легкі ланцюги|цеп| утворюють з|із| важкими|тяжкий| по одному дисульфідному| зв'язку. Обидва ланцюги|цеп| складаються з доменів, по -ПО амінокислотних залишків в кожному: у важкому|тяжкий| ланцюзі|цеп| — чотири, в легкому — два домени. N-кінцеві домени H- і L-ланцюгів|цеп|, VH, що позначаються|значаться|, і VL (V від variable — варіабельний|), визначають специфічність антитіл, їх первинна структура варіабельна|. Решта доменів характеризується постійністю|незмінність| структури і позначаються|значаться| CH1, CH2, CH3 і CL (C від constant — константний). Формою молекула антитіла нагадує букву|літера| Y, ніжка якої пов'язана з відростками|паросток| шарнірною ділянкою.

У дослідженні структури антитіл застосовуються протеолітичні ферменти. Папаїн розщеплює молекулу на три фрагменти. Два з|із| них ідентичні, одновалентні в реакції скріплення|зв'язування| антигена і названі|накликати| Fab-фрагментами (Fab від Fragment antigen binding — фрагмент, що зв'язує антиген). Третій фрагмент не зв'язує антиген, легко кристалізується і тому названий|накликати| Fc-фрагментом (Fc від Fragment crystallizable — фрагмент, що кристалізується). Пепсин розщеплює молекулу антитіла по-іншому. При цьому утворюються двовалентні F(ab')_{2-фраг-мент} і декілька осколків Fc-фрагмента, з|із| яких найбільш великий названий|накликати| pFc'-фрагментом.

Метод гібридних антитіл для зшивання антигена з|із| ферментом включає декілька етапів (мал. 2): отримання|здобуття| F(ab')_{2-фрагментов} до антигена і ферменту шляхом обробки відповідних антитіл пепсином, їх роз'єднання шляхом відновлення дисульфідних зв'язків меркаптоетанолом|, змішування отриманих|одержаних| Fab-фрагментів, видалення|віддалення| меркаптоетанолу| діалізом, що веде до реасоціації,| з|із| утворенням гібридних F(ab') 2-х фрагментів, що зв'язують антиген і фермент в єдиний комплекс.

Fc-фрагменти антитіл утворюють міцний комплекс з|із| білком A стафілокока. За наявності антитіл до ферменту і конъюгату| білок А-антіген можна отримати|одержати| комплекс E-Ат—білок А-аг.

Генноінженерний метод отримання|здобуття| міченого антигену заснований на синтезі гібридних білків за допомогою мікроорганізмів. Таким методом, використовуючи трансгенну E. coli, в лабораторії Е. С. , отримані|одержані| гібридні білки, що містять|утримувати| повну|цілковитий| амінокислотну послідовність бактерійної 3-галактозидази і специфічну послідовність білку від вірусу імунодефіциту людини або вірусу гепатиту B.

Збереження|зберігання| нативної| структури і функції зшиваних реагентів залежить від їх індивідуальних особливостей, тому тут не може бути застосований який-небудь стандартний прийом. Конкретний метод зшивання підбирається в індивідуальному порядку|лад|.

Мал. 1. Антитіло класу G: дія папаїну| і пепсину

Мал. 2. Отримання|здобуття| комплексу антигену Аг і ферменту Е методом гібридних антитіл.

К омплекс АГ—М—Е| каталітично активний, а будучи пов'язаним з Ат, нездібний каталізувати реакцію. Вільний Аг, що знаходиться|перебувати| в тестованому зразку|взірець|, конкуруючи з|із| АГ—М—Е| за пов'язання|зв'язування| з Ат, доданим|добавленим| в лімітованій кількості, веде до збільшення концентрації АГ—М—Е| і тим самим сприяє протіканню ферментативної| реакції. Це варіант з|із| позитивним модулятором ферменту. Навпаки, з|із| негативним|заперечний| модулятором активність ферменту знижуватиметься у міру зростання вільного Аг в тестованому зразку|взірець|.

Існує багато інших модифікацій гомогенного ІФА|. Назвемо|накликати| ще три з|із| них: застосування|вживання| як мітка простетичної| групи ферментів, ковалентно| пов'язаної з Аг; комплексів флуорогенних| субстратів (S) ферменту з|із| Аг (на відміну від Аг—S комплекс Ат—Аг—S не може служити субстратом ферменту, в результаті|унаслідок,внаслідок| ферментативної| реакції утворюється інтенсивно флуоресціюючий продукт); застосування|вживання| антитіл, які зв'язуються з|із| активним центром ферменту, інгібірують його активність. Час, за який проводиться гомогенний ІФА|, не перевищує 5 мин. Хоча гомогенним ІФА| властиві швидкість|прудкість| і мала трудомісткість, він характеризується нижчою чутливістю порівняно з гетерогенним ІФА|.