ЛЕКЦІЯ № 3. IМУНОФЕРМЕНТНИЙ| АНАЛІЗ

1. ВCТУП

2. АНТИГЕН

3. АНТИТІЛО

4. ФЕРМЕНТИ ЯК МІТКИ В ІФА|

4.1 Каталіз реакції |пероксидазою

5. ГЕТЕРОГЕННИЙ ІФА|

6. ЗАСТОСУВАННЯ|вживання| ІФА

|вступ|

1. ВCТУП

Чи можливе кількісне визначення того або іншого компоненту в сироватці крові, рослинному соку, культуральній рідині від мікроорганізмів, клітинному|клітковий| гомогенаті|, витяжці|витяг| із|із| зразка|взірець| грунту, сотні, що містять|утримувати|, і тисячі різних компонентів? Можливо, але|та| за однієї умови: аналізований компонент повинен володіти властивостями антигена, тобто|цебто| здатністю|здібність| викликати|спричиняти| в організмі людини або тварин синтез особливих білків — антитіл, з|із| високою специфічністю тих, що зв'язують антиген. Рішення таких задач — сфера іммуноферментного| аналізу (ІФА|). Проте|однак| заздалегідь необхідно отримати|одержати| очищений|обчищений| антиген, відповідне антитіло і підібрати|добрати| фермент, як мітку для антитіла або антигена.

І тоді можна провести реакції імунохімій: (Ат* або Аг*) , щоб визначити частку|доля| специфічного скріплення|зв'язування|.

Набори реагентів імунохімій для визначення антигенів називаються діагностикумами|. Для їх створення|створіння| необхідно вирішити задачі отримання|здобуття| антигена, антитіла, комплексу антигена або антитіла з|із| ферментом, налагодити реєстрацію імуннохімічної| реакції по активності ферменту, використаного як мітка. Разом з|поряд з,поряд із| ферментами як мітки для антигенів використовують радіоактивні і флуоресціюючі з'єднання|сполучення,сполука|: відповідно радіоімунного і флуоресцентного-імунного аналізу (РІА і ФІА|). Перевагою користується ІФА|, оскільки він не вимагає складної вимірювальної апаратури і застосування|вживання| радіоактивних з'єднань|сполучення,сполука|, а тому безпечний, придатний в польових умовах.

Аналіз імунохімії не обмежується ІФА|, РІА і ФІА|, заснованими на прямій взаємодії антигена з|із| антитілом. Є|наявний| методи виявлення і кількісного визначення антигенів по зміні їх фізичного стану при взаємодії з|із| антитілами. Так, якщо антиген розташований|схильний| на поверхні бактерійних кліток|клітина|, антитіла викликають|спричиняти| їх злипання (аглютинацію). На такому принципі засновано визначення груп крові: склеювання еритроцитів при взаємодії поверхневих|поверховий,зверхній| антигенів з|із| доданими|добавленими| антитілами (гемaглютинація|). Антитіла, додані|добавлені| в певному співвідношенні до розчину макромолекулярних антигенів, викликають|спричиняти| їх преципітацію — утворення крупних агрегатів, що візуально виявляються, з|із| молекул антигена, зв'язаних антитілами. Існують методи, засновані на реакції преципітації в гелях: при утворенні імунних комплексів Аг—ат в гелі виникають лінії преципітації, за формою цих ліній можна судити про число і імунологічну спорідненість антигенів. Для ідентифікації білків широко застосовується імуноблотінг|: спочатку суміш білків розділяють за допомогою електрофорезу| в гелі, потім на гель накладають нітроцелюлозну| мембрану і на неї електрофоретично| переносять (піддають електроблотингу|) розділені білки, які ідентифікують за допомогою мічених антитіл. Мічені антитіла широко використовують в дослідженні локалізації компонентів кліток|клітина| і тканин — це методи іммуноцито-| і іммуногістохімії|. Клітки|клітина|, що мітяться|цілитися| флуоресціюючими антитілами, можна відокремити|відділити| від немічених кліток|клітина| — метод проточної цитофлуориметрії|. Хроматографічні| колонки з|із| сорбентом, з|із| яким ковалентно| пов'язаний антиген (або антитіло), використовуються в афінній| хроматографії — відділенні|відокремлення| відповідним антитілом (або антигеном) з|із| сумішей , в результаті|унаслідок,внаслідок| утворення імунних комплексів (див. розділ "Антитіло"). Ще одне застосування|вживання| аналізу імунохімії — іммуносенсори|: п'єзокристал, покритий антигеном (антитілом), в результаті|унаслідок,внаслідок| скріплення|зв'язування| антитіл (антигена) збільшує свою масу і міняє|змінювати,замінювати| частоту резонансних коливань в змінному електричному полі, що дозволяє реєструвати зміну маси п’єзоелектрика| .

Таким чином, ІФА| — це лише один із способів визначення антигенів, що набув широкого практичного поширення, завдяки можливості|спроможність| кількісних визначень, високої чутливості і комерційної доступності. У науково-дослідній роботі ці можливості|спроможність| методів імуннохімій завжди використовуються разом з ІФА| і навіть із застосуванням одних і тих же реагентів. Тому справжня|теперішній,даний| робота обмежується ІФА|.

2. Антиген

Антиге́н — речовина, зазвичай органічного походження, що має ознаки генетичної відмінності і при введенні в організм викликають специфічний імунний ефект. Імунна система розпізнає цю речовину як чужорідну і виробляє антитіла для боротьби із нею. В класичній імунології до антигенів відносять віруси, бактерії, мікроскопічні гриби, цілі клітини тваринного походження. Це повноцінні антигени. Антитіла утворюються не проти всієї молекули білка або бактерійної клітки|клітина|, а тільки|лише| до невеликих ділянок на їх поверхні — антигенним детермінантам (епітопам|). Такі ділянки у|в,біля| білків включають не менш п'ять амінокислотних залишків. Антигенні детермінанти розгалужених молекул полісахаридів представлені|уявлені| ланцюжками з|із| чотирьох—шести| залишків.

Повні і неповні (гаптени). Антиген, якому властива антигенність, називається гаптеном. Гаптени викликають імунну відповідь тільки після кон'югації з високомолекулярними носіями. Гаптенами можуть бути прості хімічні сполуки, наприклад, глюкоза або тринітрофенол. Вони стають імуногенними лише після з'єднання з білковим носієм, наприклад, з білковою молекулою. При відповіді на гаптен, який поєднаний з білком — носієм, В-лімфоцити розпізнають його, а Th-лімфоцити — білкову молекулу.

Розчинні та корпускулярні. Розчинні (чужорідні білки, токсини, продукти деградації вірусів та бактерій) і корпускулярні (бактерії, віруси, чужорідні еукаріотичні клітини) антигени по-різному сприймаються імунною системою і, викликають різні форми імунної відповіді. В основі такого розділення лежить характер представлення антигенів клітинам імунної системи.

Екзогенні та ендогенні. В залежності від джерела надходження до організму.

Т-залежні і Т-незалежні. Антигени, які викликають продукцію антитіл, можна поділити на тимусзалежні та тимуснезалежні. У процесі відповіді на тимусзалежні антигени В-лімфоцити потребують «допомоги» Т-лімфоцитів-хелперів. Серед цих антигенів можна виділити дві основні групи: цитокіновоопосередковані та власне Т-лімфоцитарні антигени. Відповідь на тимуснезалежні антигени, яких є менше, ніж попередніх, не потребує допомоги з боку Т-лімфоцитів. До них серед інших належать: ліпополісахариди оболонок бактерій (LPS), декстран і очищений білок туберкуліну. Певні тимуснезалежні антигени містяться в багатьох вірусах, бактеріях і грибках.

Тимуснезалежні антигени. Тимуснезалежні антигени теж можна поділити на дві групи. Антигени з властивостями поліклональних активаторів В-лімфоцитів і здатністю до стимуляції імунної відповіді (наприклад, у новонароджених мишенят, у яких імунна реактивність ще не розвинена). Ці антигени передають В-лімфоцитам як сигнал І, так і сигнал II. Сюди належать LPS і декстран. Їх позначають символом ТІ-1 (thymus independent). Антигени, які не мають рис поліклональних активаторів Я-лімфоцитів і не здатні викликати відповідь у новонароджених мишенят. Це полівалентні антигени, які діють вони не тільки безпосередньо на В-лімфоцити, але й опосередковано через цитокіни, що виділяються під їх впливом іншими клітинами, наприклад NK-клітини. До цієї групи належать Ficoll і полісахарид пневмококів. їх позначають символом ТІ-2. Ці антигени не є цілком «тимуснезалежні». За певних обставин, вони можуть безпосередньо стимулювати Т-лімфоцити.

Властивості антигенів.

В межах одного антигену може знаходитися багато місць, до яких можуть приєднуватись антитіла. Це, так звані, епітопи або антигенні детермінанти. Епітопи однієї молекули можуть бути ідентичні або різні, можуть зв'язуватися з антитілами однакової або різної специфічності. Антиген, котрий містить багато епітопів, називається полівалентним. У молекулі білка найбільш антигенними є випуклі, рухомі щодо даної молекули фрагменти, які мають від'ємний заряд. Ні антиген, ні місце антитіла, що зв'язує антиген, не є статичними структурами. Вони характеризуються певною еластичністю щодо своєї форми. Використовують також термін тканинні антигени. Мається на увазі комплекс антигенів, притаманних певному органу чи тканині. Базується на різних фізіологічних функціях органів, що визначає їх певну біохімічну особливість. Пухлинні антигени — це специфічні розчинні чи асоційовані з клітинами речовини, що з'являються в організмі під час пухлинного росту. Часто їх називають раково-ембріональними, оскільки вони характерні також для ембріонального розвитку і з'являються в організмі жінки під час вагітності. Такими антигенами є, наприклад, альфа-фетопротеїн і трофобласт-специфічний глобулін, їх визначення має значення для діагностики як вагітності, так і пухлинного росту.

Антигенність та імуногенність.

Антигенність (антигенна специфічність) — це здатність комплементарно зв'язуватися із антиген-специфічними рецепторами В і Т клітин. Вона притаманна майже всім відомим речовинам. Антигенами можуть бути пептиди, амінокислоти, вітаміни, і навіть АТФ, дінітрофенол чи іони металів. Але якщо просто ввести до організму одну з цих низькомолекулярних речовин, імунної відповіді не відбудеться.

Імуногенність — це здатність викликати імунну відповідь, тобто стимулювати цілу низку подій, необхідних для активації імунних клітин. Імуногенність залежить як від структури антигену (молекулярна вага, просторова будова), так і від стану імунної системи реципієнта (репертуар білків гістосумісності та Т-клітинних рецепторів). Силу імунної відповіді до слабкого антигену можна підвищити за допомогою ад'ювантів — речовин, що сприяють неспецифічній стимуляції імунної системи: мінеральні олії (ад'юванти Фройнда), окис алюмінію.

Розчинні антигени. Такими антигенами класифікуютсья та сприймаються і представляються як екзогенні (зовнішні), і результатом їх розпізнання є активація В-лімфоцитів і синтез антитіл. Антигени бактерій і вірусів часто синтезуються всередині інфікованих клітин і тому сприймаються імунною системою як ендогенні (внутрішні). Результатом їх розпізнання є активація цитотоксичних Т лімфоцитів, що знищують інфіковані клітини разом із інфекційним агентом.

Т-залежні антигени. Ці антигени представляють більшість та потребують участі у своєму розпізнанні Т-лімфоцитів. Деякі антигени, що містять фрагменти, які багато разів повторюються (полісахариди бактерій), здатні давати достатній сигнал В лімфоцитам без участі Т і називаються Т-незалежними. Вони викликають тільки синтез антитіл.

По відношенню до організму реципієнта. По відношенню до організму реципієнта антигени діляться на ауто- (власні), ало- або ізо- (свого виду) та гетеро- або ксеноантигени (іншого виду). Потужність імунної відповіді півищується від ауто-до гетероантигенів.

Існують також неповноцінні антигени — гаптени|. Антитіла до гаптенам| утворюються лише при їх посадці на полімерну матрицю, яка використовує білки, полімери клітинних|клітковий| стінок бактерій, синтетичні поліелектроліти|. У такий спосіб|в такий спосіб| можна отримати|одержати| антитіла до антибіотиків і інших лікарських з'єднань|сполучення,сполука|, стероїдних і пептидних гормонів, вітамінів, пестицидів і навіть до такого простого з'єднання|сполучення,сполука|, як 2,4-динитрофенол. Гаптени представлені|уявлені| не тільки|не лише,не те що| низькомолекулярними з'єднаннями|сполучення,сполука|. Так, нуклеїнові кислоти самі по собі неімунногенні|. Проте|однак| антитіла до нуклеїнових кислот синтезуються, якщо вони знаходяться|перебувати| в комплексі з|із| білками. Антигенні детермінанти нуклеїнових кислот — три-| і тетрануклеотиди|.

Часто|частенько| виділити і очистити антиген, наприклад вірусний білок, буває складно. Адже його треба мати у відчутних кількостях, якщо йдеться про створення|створіння| диагностікума|. У таких випадках для синтезу антигена використовують генноінженерні| (трансгенні) бактерії або дріжджі.