Серологическое исследование

Для диагностики инфекционных болезней рыб существует ряд серологических реакций: агглютинации, иммунной гемагглютинации, преципитации, пассивной гемагглютинации, опсоно-фагоцитарной нейтрализации (вирусов, токсинов), непрямой иммунофлуоресценции.

С целью проведения реакции агглютинации готовят диагностикумы - штаммы бактерий, выращенных на мясо-пептонном агаре и образующих S-формы. Культуру смывают забуференным изотоническим раствором (NaCl - 0,85 г, 0,158 М фосфатный буфер с рН 7,17 10 мл дистиллированная вода до 100 мл) или 0,9%-ным раствором NaCl. Взвесь центрифугируют. В качестве диагностикума применяют живые или убитые (0,3%-ным формалином или 0,5 %-ным раствором фенола) бактерии.

Сыворотку крови рыб хранят в замороженном или высушенном состоянии.

Учет результатов проводят после окончания инкубации по 4-крестовой системе. Титром сыворотки является наибольшее разведение, которое дает реакцию не менее чем на 2 креста.

Схема постановки осадочной реакции агглютинации бактерий в панели с лунками

Перемешивание содержимого лунок, инкубация 4 ч при 37°С, вновь перемешивание, экспозиция при комнатной температуре 18-20 ч.

Для экспресс-диагностики используют также капельную РА на стекле с поливалентными и моноспецифическими сыворотками. Реакцию ставят и учитывают общепринятым методом.

Остальные серологические реакции пока не нашли широкого применения в производственных ветеринарных лабораториях, а используются в научно-исследовательских институтах.

Микологическое исследование

Пробы для микологического исследования берут от только что погибших или больных рыб. В замороженном виде их можно хранить до 3 сут, а консервировать до 2 сут в растворе антибиотиков (пенициллин и стрептомицин по 100 ЕД на 1 мл раствора).

В лаборатории патологический материал исследуют под микроскопом, выделяют чистую культуру возбудителя, определяют его патогенность.

Микроскопируют мазки из различных очагов поражения. Исследуют без окрашивания в капле 0,9 %-ного раствора хлористого натрия или 50 %-ного водного раствора глицерина. Для установления видовой принадлежности гриба делают посевы (не менее 5) на питательные среды. Первичные посевы проводят на плотные агаровые среды. Предположительно (по клиническим признакам) определяют вид возбудителя, выбирают состав среды, так как некоторые возбудители микозов растут на средах с определенными ингредиентами.

В исследуемом материале могут присутствовать различные бактерии, плесени. Для получения чистых культур применяют методы разделения. Так, добавление 0,5 мг/мл 2 %-ного раствора актидиона задерживает рост плесневых грибов и практически не мешает развитию патогенных грибов. Снижение рН питательной среды до 3-4 не прекращает роста грибов, в то время как бактерии, особенно сапрофиты, могут развиваться только при рН 7,0-8,5. При температуре 5-10°С большинство бактерий в отличие от грибов не растет.

При посеве на плотные питательные среды можно обнаружить отдельные колонии. Интересующую колонию осторожно переносят на новую питательную среду и получают рост одного вида микроорганизма.

При посевах для выделения возбудителя рыбу вскрывают, отдельными ножницами вырезают маленькие кусочки ткани из очага поражения, переносят во флаконы со стерильным раствором стрептомицина и пенициллина (по 500 ЕД в 1 мл) на 15-20 мин. Затем кусочки материала переносят на агар Чапека в чашки или пробирки.

Микроскопические исследования патологического материала проводят в капле 0,9 %-ного раствора хлористого натрия, накрытой покровным стеклом, при опущенном конденсаторе или с прикрытой диафрагмой.

Хорошо сформировавшиеся колонии гриба на агаре пересевают на скошенный агар в пробирки.

По культуральным признакам колоний гриба на средах, при изучении под микроскопом мицелия, расположения спор определяют его вид.