Ферменты в пищевых технологиях. Иммобилизованные ферменты.

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы, вырабатываемые живыми клетками, но в своем действии независимы от их присутствия (ферменты могут работать как в клетке, так и вне клетки). Ферменты называют энзимами, что в переводе означает «сложнейший».

На действии ферментов основано производство спирта, вина, пива, чая, кисломолочных продуктов, сыров, хлебобулочных изделий и др. Действием ферментов объясняется созревание и пересозревание плодов и овощей, созревание и порча мяса и рыбы, сохраняемость зерна, муки, хлеба.

Молекулярная масса ферментов колеблется от 15000 до 1 млн. Действие фермента на субстрат отличается строгой специфичностью.

По своему строению все ферменты делят на 2 группы:

• однокомпонентные

• двухкомпонентные

Однокомпонентный фермент состоит только из белка, обладающего каталитическими свойствами (амилаза)

Двухкомопонентный фермент состоит из белка соединенного с веществом небелковой природы, которое называется простетической группой. (пируватдекарбоксилаза катализирует расщепление пировиноградной кислоты до уксусного альдегида и углекислого газа. Коферментом этого фермента явл. витамин В₁. Этот фермент играет большую роль в процессе дыхания, брожения и углеводного обмена).

Активную простетическую группу называют – агон или кофермент, а белковую – ферон или апофермент.

Такие витамины как А,Д,Е,К,С не являются коферментами ферментов.

У однокомпонентных ферментов роль активных групп играет определнная группировка, входящая в состав ферментного белка – «активные центры».

Активный центр – это часть молекулы белка с помощью которой фермент соединяется с субстратом (вещество на которое действует фермент). В случае нарушения активного центра фермент теряет свою активность.

От неорганических катализаторы отличаются тем, что их активность зависит от возраста, выполняемой работы, физиологического состояния организма, что неприсуще другим катализаторам.

Скорость ферментативных реакций гораздо выше, чем других катализаторов. О космических скоростях ферментативных реакций свидетельствуют следующие примеры: 2 г пепсина, вырабатываемого слизистой оболочкой желудка способно за 2 часа расщепить 100 кг денатурированного яичного белка, а 1,6 г амилазы – фермента, вырабатываемого поджелудочной железой и расщепляющей крахмал, способна за сутки расщепить 175 кг крахмала.

Сущность ферментативной реакции заключается в образовании ферментсубстратного комплекса, когда при непосредственном взаимодействии фермента и субстрата происходит перегруппировка внутренних связей субстрата, приводящая к его активации:

Е + S ЕS + Е + Р₁ + Р₂

Е – фермент (энзим)

S – субстрат (вещество с которым взаимодействует фермент)

Р₁ и Р₂ - продукты катализа (реакции)

ЕS – субстратферментный комплекс

В основе действия ферментов как биологических катализаторов лежит способность повышать скорость ферментативных реакций за счет снижения энергии активации субстрата, т.е. каким-то образом его активировать.

Например, для расщепления сахарозы до глюкозы и фруктозы без катализатора надо затратить энергию активации = 134 кДж/моль, если катализатором являются ионы водорода, то энергия активации = 107 кДж/моль, а если катализатором является фермент -фруктофуранозидаза, то энергия активации = 39 кДж/моль.

Для каждого фермента существуют оптимальные условия, при которых он принимает максимальную активность. Такие условия обычно характеризуют: температура, рН, наличие активаторов (вещества, повышающие активность ферментов: ионы металлов – натрия, кальция, калия, магния, ионы йода, врома, хлора и др.) и ингибиторов (вещества, подавляющие действие ферментов), концентрация фермента и субстрата.

Под активностью фермента понимают то количество весовых единиц субстрата, превращение которого катализирует одна весовая единица фермента в оптимальных условиях.

Ингибиторы ферментов делят на общие и специфические.

К общим ингибиторам относятся соли тяжелых металлов, трихлоруксусная кислота, концентрированные минеральные кислоты, т.е. все те вещества, которые вызывают денатурацию белков.

Механизм действия специфических ингибиторов сводится к тому, что они вступают в соединение с активным центром фермента, блокируют его и фермент становится неактивным, т.е. он не может взаимодействовать со своим субстратом.

Специфические ингибиторы дают возможность целенаправленно изменять обмен веществ, ускорять, замедлять или полностью приостанавливать течение точно известных биохимических реакций (химические вещества, средства химической защиты от насекомых и болезней растений, пищевые добавки).

Различают ингибирование конкурентное и неконкурентное.

При конкурентном ингибировании ингибитор имеет такую же структуру как и субстрат, т.е. является структурным аналогом субстрата, он вступает в соединение с ферментом по месту соединения с субстратом, блокирует фермент и он становится неактивным.

Главная особенность конкурентных ингибиторов состоит в том, что ингибитор и субстрат взаимодействуют с одним и тем же участком активной поверхности фермента, именно поэтому они и конкурируют, т.е. каждый стремится занять свое место на активном центре фермента.

При неконкурентном ингибировании ингибитор присоединяется к ферменту не по месту соединения с субстратом, а к какому-либо участку, который называется – аллостерическим (allos – другой). При этом происходит изменение активного центра субстрата и субстрат не может присоединиться к активному центру фермента.

В одних случаях в пищевых технологиях ферменты играют положительную роль, а в других – отрицательную. Отрицательная роль связана с потерей пищевой ценности сырья, что наблюдается при хранении плодоовощного сырья, молока. В этом случае стремятся инактивировать ферменты или снизить их активность (понизить температуру вплоть до замораживания, высокотемпературный шок, добавление ингибирующих веществ- консервантов).

Классификация ферментов

1. оксидоредуктазы (катализирующие окислительно-восстановительные реакции путем переноса атомов водорода или электронов от одного субстрата к другому) – каталазы, пироксидазы…

2. трансферазы (катализирующие реакции переноса различных групп – РО₄^3-, СН₃, NН₂ и др. от одного субстрата к другому) – аминотрасферазы, фосфаттрансферазы…

3. гидролазы (катализирующие реакции гидролитического расщепления внутримолекулярных связей углерод-гетероэлемент в субстрате, чаще всего углерод-кислород и углерод-азот (в пептидных, амидных, гликозидных и сложноэфирных группировках)) – липазы, эстеразы, амилазы, протеазы…

4. лиазы (катализируют реакции негидролитического отщепления различных групп от субстрата с образованием двойных связей углеро-углерод и углерод-гетероэлемент (О, S, N), а также обратные реакции - присоединения групп по разрывающимся двойным связям) – пируватдекарбоксилаза, аспартаза…

5. изомеразы (катализируют реакции изомеризации различных орг.соединений, т.е. изменения в прелелах молекулы субстрата) – глюкоизомераза, триозофосфатизомераза…

6. лигазы (синтетазы) (ускоряют синтез сложных орг.соединений из простых – катализируют реакции соединения двух молекул субстрата, сопровождаемые расщеплением дифосфатной связи в молекуле аденозинтрифосфорной кислоты и молекулах других нуклеозидтрифосфатов) – ДНК-лигаза, триптофансинтетаза…

Сейчас наиболее широко в промышленности используют следующие группы ферментных катализаторов:

1. карбогидразы, расщепляющие крахмал и низкомолекулярные углеводы (дисахариды) – амилазы, глюкоамилазы, мальтазы, лактазы, сахаразы и т.д.;

2. протеазы, расщепляющие белки и продукты их распада (различные пептиды)- протеиназы и пептидазы;

3. пектиназы, гидролизующие пектины – пектинэстеразы и полигактуроназы;

4. целлюлазы и гемицеллюлазы, разрушающие целлюлолзу (клетчатку), гемицеллюлозы, камеди и гумми;

5. липазы, гидролизующие жиры;

6. ферменты негидролитического действия – глюкооксидаза, каталаза, липоксигеназа и пероксидаза.

Области применения амилаз

Хлебопечение. Прибавление в опару или тесто 0,002-0,003% препарата амилазы, т.е. 20-30 г сухого препарата на 1 т муки, совершенно изменяет качество хлеба: резко улучшается его вкус, аромат, окраска корки, увеличивается удельный объем, пористость, содержание сахара, улучшается вся структура хлеба, а также режим тестоведения и ход производства в целом. Происходит это потому, что фермент, расщепив в определенной степени крахмал, увеличивает содержание сахара в муке. Брожение, газообразование и другие процессы проходят интенсивнее и качество хлеба становится намного лучшим. С помощью амилазы в настоящее время за рубежом улучшают хлебопекарные (диастатические) свойства пшеничной и ржаной муки.

Наиболее удобной для этой цели оказалась амилаза плесневых грибов. Она значительно превосходит амилазу, полученную из растительного сырья или бактерий.

До последнего времени для улучшения качества пшеничного хлеба применяли ферменты ячменного солода, а для улучшения аромата и вкуса заварного ржаного хлеба (типа «Московский» или «Бородинский») – ферменты так называемого красного ржаного солода. Производство последнего очень длительно (10-12 суток) и связано с потерей 20-25% сухого вещества зерна. Оказалось возможным вместо красного солода использовать амилазу грибов. При этом было сохранено высококондиционное зерно, резко ускорен процесс приготовления заварки и улучшено качество заварных сортов хлеба.

Многие ферментные препараты микробного происхождения являются комплексными и наряду с амилазами содержат значительные количества протеаз. Наличие последних часто бывает опасным, так как они могут частично расщеплять клейковину муки, что отрицательно сказывается на формоустойчивости хлеба, особенно если клейковина была слабой. В связи с этим более целесообразен выпуск препаратов, содержащих только амилазы с тем, чтобы количество протеаз, если их введение необходимо, точно дозировалось путем добавления специального препарата.

Кондитерская промышленность. Здесь амилазы могут быть использованы для таких же целей, как и в хлебопечении. При производстве изделий из теста (муки) они улучшают пористость и аромат изделий, увеличивают содержание сахара в них, улучшают режим тестоведения и имеют ряд других технологических преимуществ.

Спиртовая промышленность. Здесь применение амилолитических ферментов имеет особенно большое значение. Ранее источником их обычно служил растительный материал (солод), но в последнее время доказано, что осахаривающая амилаза грибов наиболее эффективна, в частности, по сравнению с бактериальной. Ферменты из плесневых грибов действуют весьма быстро при относитеольно низких температурах и дают хорошую сахарификацию. В процессах осахаривания крахмалистого сырья они являются полноценным заменителем зернового солода, превращая в течение 30-40 мин крахмал в низкомолекулярные сбраживаемые сахара. Последующий процесс бродения протекает нормально.

Применение при производстве спирта грибной амилазы вместо солода позволяет:

1. высвободить десятки тысяч тонн высококачественного зерна;

2. повысить выход спирта;

3. резко сократить во времени процесс получения ферментного препарата. Как известно, для получения активного зернового солода необходимо 7-8 суток, для выращивания же культуры гриба и получения из нее препарата фермента – несколько десятков часов;

4. уменьшить количество производственных площадей,, а также расход весьма тяжелого труда и всех видов энергии.

Пивоварение. Здесь амилазы используются при замене зернового солода. Уменьшение затрат зерна на единицу готового продукта при сохранении его качества и состава, представляет одну из основных проблем в пивоварении. Известно, что при выращивании солода потери сухих веществ ячменя в процессах дыхания и формирования очень велики и достигают 10%. Таким образом, если в производстве пива уменьшить количество солода, то тем самым можно снизить потери ценных веществ зерна. На многих заводах заменяют 30-50% солода несоложенным сырьем, т.е. ячменем 2-го и 3-го сортов, кукурузой в виде обезжиренной муки крупного помола, низкобелковой пшеницей с содержанием клейковины не более 15-18% или просом. Вместо 50% замененного солода в смесь вводят около 1% активного амилолитического препарата и молочную кислоту для создания требуемого рН. Если повысить количество ферментного препарата до 4-5%, то можно вообще обойтись без солода и из несоложенного сырья получить сусло, которое практически не будет отличаться от сусла из солода. Из этого материала можно получать пиво, которое почти неотличимо от обычного. Если затор (смесь солода с водой) в процессе такого способа производства подвергнуть ГТО определенного режима, то он приобретает вкус и аромат солода.

В ряде стран (Дания, Германия, Япония, США) для осахаривания сырья при использовании несоложенных материалов применяют амилолитические препараты бактериального происхождения. Замену солода производят на 20-30%, но иногда и больше до 80-90%. Расчеты, проведенные в нашей стране, показывают, что если пивоваренную промышленность перевести на описанную выше технологию, то при этом можно будет сберечь 25-30 тысяч тонн ценного зернового сырья.

Крахмало-паточная промышленность. Применение здесь амилаз разнообразно и широко. Прежде всего, при их помощи может быть получена растворимая форма крахмала, отличающаяся орт нерастворимой тем, что при неинтенсивном действии фермента в частицах разрывается лишь некоторая часть связей и крахмал приобретает новые свойства. Далее при помощи бактериальных и растительных амилаз хорошо удается получить патоку, в частности из кукурузной и маисовой муки. При помощи ферментов, кроме мальтозной и глюкозной паток, можно получать чистую глюкозу.

В процессе производства различных видов паток и глюкозы, а также разнообразных сладких сиропов, ферментативные реакции вытесняют кислотный гидролиз крахмала и декстринов. В сущности кислотный гидролиз представляет собой хаотическое, трудно управляемое воздействие, тогда как фермент расщепляет молекулы крахмала по характерному узору, разрывая строго определенные связи. Очень часто амилазами обрабатывают крахмал, частично уже гидролизованный кислотой, и его дальнейший распад идет уже по заданному плану, с использованием специфичности различных карбогидраз.

При кислотном гидролизе соотношение количеств декстрозы, мальтозы, высших олигосахаридов и декстринов получается примерно одинаковым, что дает некоторый определенный декстрозный эквивалент (Д.Э.). Патока, образованная с помощью амилазы солода (гидролизат крахмала), будет иметь другой состав. Применяя в отдельности или в сочетании растительную и грибковую амилазы, содержащие альфа и бета амилазы, а также амилоглюкозидазы и мальтазы, можно получать практически неограниченное количество различных продуктов гидролиза (гидролизатов) крахмала и, следовательно, патоки с любыми желательными свойствами.

Различные виды паток используют главным образом в кондитерском производстве, где они предупреждают кристаллизацию сахарозы и лактозы, улучшают консистенцию изделий и увеличивают сроки их хранения. Патоки применяют при выработке мороженого, консервированных фруктов и варенья, безалкогольных напитков, столовых сиропов и т.д.

Выпускают патоки различных типов: декстрино-мальтозную, мальтозную (продукт более глубокого гидролиза крахмала), а также мальтозные продукты, сиропы и т.д. В зависимости от назначения патоку подразделяют на карамельную, карамельную низкоосахаренную и глюкозную высокоосахаренную. Источниками для их получения служат картофельный, кукурузный или иной зерновой крахмал, различные виды муки, измельченная кукуруза, ячмень.

При производстве различных изделий из крупяных продуктов амилазы, получаемые из бактерий, грибов или растений, применяют: а) для выработки декстрина и смесей сахаров; б) для предварительной обработки (частичного расщепления крахмала) во всех тех случаях, когда из сырья вырабатывают пищевой продукт в виде хлопьев или зерен. Второй процесс очень удобен при выработке также и крупяных концентратов. Готовые продукты после гидролиза приобретают лучшие вкусовые качества, обогащаются растворимыми сахарами, компоненты их лучше перевариваются и усваиваются.

В производстве овощепродуктов, в частности пюре, супов, различных форм сушеных овощей, крахмал модифицируют таким же образом. Процесс дает ряд технологических преимуществ: для супов и пюре – необходимое разжижение, при сохранении сухого вещества в продуктах; для сушеных овощей – некоторое ускорение процесса высушивания. Во всех случаях более полно используется сырье. Быстрая «развариваемость» крупяных и овощных концентратов также является ценным преимуществом при их использовании.

Детская пища. В настоящее время в некоторых странах налажен выпуск новых пищевых продуктов, предварительно обработанных ферментами. Так, при изготовлении детской пищи крахмал или белки, или и то и другое вместе, частично гидролизуют действием амилолитических или протеолитических ферментов. Это значительно облегчает переваривание и усвоение указанных ценных веществ в организме ребенка и, кроме того, улучшает вкусовые свойства пищи.

Изделия из фруктов. В производстве различной продукции из фруктов – соков, экстрактов, некоторых сортов варенья, фруктовых пюре – применяют грибные амилазы для полного расщепления крахмала в них. Остатки крахмала могут приводить к постепенному загустению продуктов, некоторому помутнению соков, экстрактов, ухудшению их товарного вида.

Отходы кондитерской промышленности часто содержат значительные количества крахмала, в особенности это относится к отходам производства конфет. С помощью бактериальных и грибных амилаз возможно выделить из них сахара и использовать их.

Можно также расщепить мешающие остатки крахмала в ликерных, шоколадных и иных сиропах, получить прозрачный, свободный от крахмала пектин и вырабатывать некоторые ароматизирующие (вкусовы) экстракты, в которых крахмал должен быть гидролизован.

Так, в Японии для приготовления концентрированных вкусовых приправ толченый рис смешивают с мелконарезанной соломой, варят на пару, затем при помощи ферментов расщепляют крахмал и белки, получая бражку. Такой продукт спиртового брожения смешивают с ранее приготовленным жидким экстрактом рыбной муки (или отходов рыбного производства) и сброженной соей и получают концентрированную приправу.

Области применения протеаз

Используются протеазы животного происхождения – пепсин (из из пепсиногена слизистой оболочки желудка), трипсин (из трипсиногена поджелудочной железы), химотрипсин (близок по ряду свойств трипсину, а специфичность его подобна пепсину), реннин (сычужный фермент) и растительного происхождения – папаин (из сока плодов дынного дерева), фицин (из млечного сока видов Фикус, например инжира), бромелаин (из стеблей ананаса). Однако наибольшее, все возрастающее применение, особенно за последнее время, находят протеазы микроорганизмов, чаще всего протеолитиченские системы бактерий и грибов.

Мясная промышленность. Наиболее интересным и перспективным (в области пищевых производств) является использование протеиназ для мягчения мяса, точнее, для придания ему нежных вкуса и консистенции. Довольно давно установлено, что качество многих сортов мяса и мясопродуктов может быть существенно улучшено в результате частичного гидролиза входящих в их состав белков. Для этой цели используют животные, растительные ферменты и протеиназы микробного происхождения.

Технологически процессы мягчения несложны. Чаще всего они сводятся к погружению мяса при определенных физико-химических условиях (рН, температуре, концентрации фермента) в раствор, в котором находится необходимый комплекс протеиназ. Этот способ в настоящее время считается наиболее удобным. Кроме него известны еще 3 способа: нанесение на поверхность мясной порции порошкообразных размягчителей, в которых имеется фермент, часто с добавкой, например соли, глютаминовокислого натрия; введение раствора фермента в ткань шприцем или, если кусок велик (полутуша), то несколькими шприцами одновременно; введение фермента в кровь животного перед убоем.

После мягчения можно использовать для получения ценных мясопродуктов такие сорта мяса, которые обычно не применялись для этой цели. Обоработкорй ферментами можно сделать мягкими различные шкурки («футляры») в мясопродуктах, которые обычно жестки и снижают качество изделий. Возможно ускорить созревание колбасных и иных фаршей, сделать их мягкими и усвояемыми, если они изготавливаются из сравнительно жесткого сырья.

Аналогичным образом протеазы можно применять в рыбной промышленности, что также имеет большое экономическое значение. Как и при обработке мяса, основным процессом здесь является частичный гидролиз белков под действием протеиназ. Он протекает и под влиянием собственных внутритканевых ферментов, но очень медленно и слабо. Введение извне протеиназ резко ускоряет созревание, изменяет структуру тканей рыбы, облегчая проникновение в нее соли, коптильных веществ или, наоборот, выход соли, т.е. отмочку. Целый ряд широко используемых процессов рыбной промышленности может быть интенсифицирован под влиянием протеолитических препаратов. К ним относятся: а) обычный посол рыбопродуктов; б) пряный посол (изготовление маринадов); в) отмочка соленой рыбы; г) копчение; д) производство рыбной кулинарии, рыбных консервов, где возможна тендеризация (мягчение) жестких сортов, ускорение тепловой обработки, ускоренное созревание; е) производство рыбных пресервов, созревающих в особенно короткие сроки; ж) производство рыбных приправ, паст, соусов; з) использование отходов рыбной промышленности, получение гидролизатов кормового и пищевого назначения.

При всех этих процессах благодаря действию протеаз улучшается качество продукции – вкус, запах, консистенция ткани, распределение жира в ней, перевариваемость и усвояемость ценных компонентов. В ряде процессов повышаются выходы до 6-8%.

Молочная промышленность. Используют при изготовлении сыра – характерное ферментологическое производство. Большинство известных нам производственных процессов, при которых используются протеиназы, основано на способности последних расщеплять белки, но протеолитиченские ферменты обладают и другим действием -–способностью свертывать молоко. Это свойство реннина (химозин, сычужный фермент), а также пепсина с давних времен используется в пищевой промышленности. При свертывании из молока выделяется белок казеин, перешедший в нерастворимую форму. Сгусток этого белка включает почти весь имеющийся в молоке жир. Под влиянием молочнокислых бактерий из него затем образуются различные сорта устойчивого сыра, содержащего наиболее полноценные питательные вещества и обладающего превосходными органолептическими свойствами. Роль протеиназ в сыроварении не ограничивается первым процессом свертыванием молока; они играют ведущую роль и в процессах созревания сыров, так как вкус и аромат последних во многом связан с накоплением в них низкомолекулярных продуктов гидролиза белков – АК и пептидов.

Наряду с производством сыра процесс ферментативного свертывания молока используется для получения сырковой массы, казеина и т.д.

С помощью протеолитических ферментов получают различные белковые гидролизаты молока, расщепляя в нем белки папаином, бромелином, протеиназами грибов и бактерий. Вырабатывают, например, легко усвояемые молочные продукты для больных или детей. Коровье или козье молоко гидролизуют, нагревая с препаратами протеаз при 50-60⁰С, прибавляя лимоннокислые и фосфорнокислые соли (натрий или калий), заменяя на натрий или калий часть содержащегося кальция. Белковые гидролизаты, необходимые для приправ, специальных диет и кормов, получают, проводя глубокий ферментативный протеолиз белков мяса, рыбы или молока.

Действием протеаз, кроме того, можно предупреждать запах окисления в молоке (панкреатином) и стабилизировать сгущенное молоко (протеолитическими ферментами различного происхождения).

Хлебопечение и кондитерская промышленность. Здесь протеолитические ферменты используются при изготовлении хлеба, сухарей (галет), печенья. Если к тесту добавить некоторое количество препарата протеиназы так, чтобы протеолитическое действие было очень строго дозировано, то происходит сравнительно неглубокий гидролиз белковых веществ. При этом уменьшается время замешивания теста, увеличивается его растяжимость (упругость), улучшаются структура и объем изделия. Очень опасен в данном процессе излишек протеиназы: нужнотакже тщательно контролировать время и условия действия фермента во время выдерживания и выпечки, так как в противном случае может получиться «неуправляемое» тесто.

Если протеолиз белков в тесте проведен правильно, то возникает ряд технологических преимуществ: ускоряется тестоведение; введение большего или меньшего количества протеиназ позволяет произвольно изменять продолжительность замеса теста; облегчается машинная обработка теста, хлеб получают с хорошей структурой мякиша.

Эффективно используются протеиназы в производстве крупяных изделий, различных пищевых продуктов из злаков. В результате частичного гидролиза (модификации) содержащихся в них растительных белков улучшаются вкусовые качества этих изделий и их перевариваемость. Технологические процессы их выработки упрощаются, в частности, облегчается и ускоряется высушивание, причем, естественно, снижается количество затрачиваемой энергии.

Пивоварение.В этой области протеиназы применяют для стабилизации пива от помутнения, чтобы предупредить развитие в нем нежелательных газов. Помутнение пива, изменение его коллоидно-химической устойчивости происходит потому, что имеющиеся в нем растворимые белки постепенно денатурируются и вместе с другими веществами выпадают в осадок. Ферменты расщепляют белки, и продукты распада не осаждаются. В результате гидролиза белков, кроме того, ускоряется процесс фильтрования пива, что является ценным технологическим преимуществом. Иногда для стабилизации пива используют протеиназы, полученные из хвои или шишек сосны, кожуры миндаля (хитиназа).

Предварительный частичный гидролиз белков удобен при выработке сухого яичного порошка, замороженной яичной массы, сухого молока. Гидролиз облегчает высушивание, повышает вкусовые свойства и усвояемость продуктов. При выработке молока в виде таблеток в сухое молоко вводят сахар, измельченное затверделое масло и ряд гидролитических ферментов (липазу, галактазу), но в первую очередь протеолитические ферменты.

Глубокий гидролиз белков с помощью протеаз позволяет получить разнообразные продукты типа соусов и приправ.

Области применения пектиназ

Пектиназы гидролизуют растительные полисахариды, называемые пектиновыми веществами, или пектинами. Эти вещества обычно содержатся в растениях не в свободном виде, а в виде сложного комплекса, известного под названием протопектин. Схематически состав протопектина можно представить так:

Арабан – метоксилированная полигалактуроновая кислота – галактан

В основе структуры лежит цепь из остатков D-галактуроновой кислоты, соединенных друг с другом 1,4-глюкозидными связями. Карбоксильные группы остатков галактуроновой кислоты в большей или меньшей степени этерифицированы метиловым спиртом, т.е. содержат остатки СН₃О-, присоединенные к шестому углеродному атому эфирной связью. Арабан – полисахарид, состоящий из остатков углевода арабинозы. Галактан – высокомолекулярный полисахарид, построенный из частиц галактозы.

При действии комплекса пектолитических ферментов прежде всего происходит отщепление от протопектина арабана и галактана. Предполагают, что это производит специальный фермент – протопектиназа, однако точных доказательств его существования нет. После отщепления обоих полисахаридов остается растворимый пектин, т.е. метоксилированная полигалактуроновая кислота. Именно она расщепляется другими пектолитическими ферментами.

Два основных фермента гидролизуют растворимый пектин – пектинэстераза (пектаза) и полигалактуроназа (пектиназа). Пектинэстераза разрывает боковые эфирные связи и отщепляет при этом метиловый спирт, обнажая высокореактивные карбоксильные группы. Второй фермент, действующий на растворимый пектин, расщепляет основную цепь полигалактуроновой кислоты. Известно, что в молекуле последней не все СООН-группы этерифицированны и содержат метоксильную группу. Пектинэстераза действует именно на эти участки, деметоксилируя кислоту. Полигалактуроназа же разрывает связи между теми остатками полигалактуроновой кислоты, которые не содержат метоксильных групп.

Когда при действии пектинэстеразы обнажаются карбоксильные группы, то при их участии в присутствии бивалентных катионов (Са²⁺) образуются нерастворимые соли, которые выпадают в осадок и могут быть легко удалены. Полигалактуроназа же расщепляет высокомолекулярный пектин, в результате чего устраняется его предохраняющее коллоидное действие, уменьшается вязкость растворов и суспендированные в его присутствии частицы осаждаются. При этих гидролитических превращениях теряется важнейшее свойство пектиновых веществ – их желирующая способность, т.е. способность образовывать плотные студни в присутствии кислоты и сахара. Действие пектинрасщепляющих ферментов всегда связано с резким снижением вязкости системы.

Пектиназы применяют в следующих областях пищевой промышленности:

1. виноделии;

2. производстве плодоягодных соков и безалкогольных напитков;

3. изделий из фруктов – желе, концентрированных соков, пюре, фруктовых и овощных консервов;

4. ликеро-водочном производстве;

5. производстве кофе и кофейных концентратов;

6. получении пектина с низким содержанием метоксила.

Пектиновые вещества, являясь гидрофильными коллоидами, повышают водоудерживающую способность растительной ткани и тем самым препятствуют полному отделению сока, задерживают выделение взвешенных частиц в соке, сусле, вине, что приводит к образованию устойчивой неоседающей мути, придает соку высокую вязкость и затрудняет его осветление и фильтрование.

В виноделии пектолитические ферменты оказываются эффективными при прессовании, осветлении и отстаивании виноматериалов. Прибавление пектиназ к винограду, яблокам, ягодам и фруктам при их размоле или раздавливании дает повышенный выход сока после прессования. Вино, полученное из материалов, обработанных ферментами, имеет более глубокий и яркий цвет, прозрачнее и крепче, если его ферментация проведена полностью.

Эти ферменты совершенно безвредны и вполне активны в условиях, обычных для процессов виноделия. Они способствуют извлечению красящих, дубильных и экстрактивных веществ из сырья, что повышает качество готовой продукции и особенно ценно при некоторых технологических процессах, например при производстве вин «по красному способу» – с настаиванием на мезге.

В производстве плодово-ягодных соков и безалкогольных напитков пектиназы применяются для решения трех главных задач: 1) увеличения выхода готового продукта; 2) осветления растворов; 3) ускорения их фильтрования.

Фруктовые консервы. Пектиновые ферменты необходимы для получения фруктовых соков большой плотности (концентрации) или фруктовых пюре. Используют пектиназы и при производстве различных фруктовых желе.

В производстве кофе и кофейных концентратов пектолитические ферменты применяют также для удаления железообразного слоя, который бывает на поверхности кофейных бобов.

Области применения липаз

Применение липаз все более расширяется и сейчас уже можно назвать не менее 10-11 отраслей народного хозяйства, где эти ферменты – животного или микробного происхождения – используются весьма успешно или предупреждается их опасное, неблагоприятное действие:

1. сыроделие

2. производство молочного шоколада

3. кондитерская промышленность

4. производство сухого яичного порошка

5. кожевенная промышленность (обезжиривание шерсти, щетины, кож)

6. производство шелка

7. «промышленность очистки» (производство моющих средств, чистка одежды, мебели)

8. получение лечебных медицинских препаратов

9. производство муки

10. производство крупяных изделий

11. выработка растительных масел.

Именно в последних трех областях учитывается и предотвращается вредное действие липаз, тогда как в первых восьми – действие липолитических ферментных препаратов играет ценную положительную роль.

В сыроделии липазы используются при производстве сыров типов Рокфор, Чеддер, итальянских сыров. Фермент частично гидролизует жир, что связано с возникновением лучших органолептических свойств (вкуса, аромата) и значительно, на месяцы, ускоряет сроки созревания. Применяются липазы животного происхождения или из грибов.

Липазы оказались полезными для предупреждения образования суспензий в сброженных молочных напитках.

В производстве молочного шоколада липаза обусловливает образование жирных кислот, способствующих улучшению его вкуса и аромата.

В кондитерской промышленности липазу рекомендуют для гидролиза жира в сухом яичном белке; в присутствии жира пенообразующая способность белка понижается. Если добавленная липаза расщепит примесь жира, то сбиваемость белка возрастет и этим улучшается качество бисквитного теста. Иногда фермент вызывает появление мыльного привкуса в бисквитах или в овсяном печенье. Причиной этого является расщепление жира, образование жирных кислот, которое происходит под влиянием липазы пшеничной муки.

Зерновая липаза играет важную роль в процессе порчи различных зерновых продуктов, при их прогоркании. Процесс этот происходит в результате действия двух ферментов – липазы и липоксигеназы.

Кретович показывает его в виде следующей схемы:

Глицериды
	липаза
Жирные кислоты + глицерин
	липоксигеназа
Гидроперекиси жирных кислот
Различные альдегиды и кетоны (обладающие неприятным запахом и вкусом)

Процесс начинается с действия липазы, которая подготавливает жирные кислоты, из которых затем и образуются вредные продукты – окисленные вещества.

Действие липаз приходится учитывать в производстве растительных масел и при транспортировании и обработке разных масличных семян, поскольку здесь весьма нежелательным является нарастание кислотности.

Области применения эстераз

Расщепляют эфирные связи. Эти ферменты участвуют в образовании (и разрушении) веществ, обусловливающих специфический вкус и аромат многих продуктов. Эстеразы, в частности получаемые из плесневых грибов, влияют на течение процесса созревания вин. Можно полагать, что благодаря действию этих ферментов можно будет ускорять старение вин, получать продукты с более резко выраженными тонами аромата и вкуса и даже продукты с новыми органолептическими свойствами. Однако эстеразы могут иногда оказывать и вредное действие. Так, эстераза, продуцируемая Asp. Sojae, расщепляет н-бутил-п-оксибензоат, применяемый как консервант соевого соуса.

Негидролитические ферменты

В практике пока используется очень небольшое количество таких ферментов: глюкозооксидаза, каталаза, пероксидаза и липоксигеназа (липооксидаза). Кроме того, в сырье всегда учитывается действие оксидазы аскорбиновой кислоты, фенолоксидазы (тирозиназы) и некоторых других ферментов.

Ферменты глюкооксидазной системы могут быть использованы для двух основных целей – окисления глюкозы и связывания (удаления) кислорода.

С ₆Н₁₂О₆ + О₂ + Н₂О глюкооксидаза С₆Н₁₂О₇ + Н₂О₂

Глюконовая к-та

Основные области применения фермента: 1. Предохранение пищевых продуктов от окисления (удаление из них кислорода); 2. Предохранение продуктов от нежелательных изменений путем предварительного окисления глюкозы, входящей в их состав; 3. Хранение и транспортировка окисляющихся материалов в бескислородных условиях.

Широкое промышленное применение имеет процесс обессахаривания яиц перед их высушиванием. Если в яичном порошке содержится глюкоза, то ее постепенное окисление приводит к ухудшению продукта – появлению коричневой окраски, неприятного привкуса и др. Предварительное окисление глюкозы в глюконовую кислоту предотвращает эти нежелательные изменения.

При хранении жидких продуктов глюкозооксидазу вместе с небольшим количеством глюкозы растворяют в них перед упаковкой, и весь остаточный кислород в продукте оказывается связанным (удаленным). При хранении, например, консервированных безалкогольных напитков в них могут происходить три вида весьма нежелательных изменений: потеря цвета, изменение запаха и коррозия банки. В зависимости от количества оставшегося кислорода могут возникать разнообразные запахи с различной интенсивностью. Прибавление небольших количеств фермента сильно увеличивает сроки хранения напитков при сохранении их качества и уменьшает коррозию металлических банок. Поэтому фермент применяют для предохранения разнообразных фруктовых соков, яблочного вина, газированных безалкогольных напитков и пива.

Глюкозооксидаза эффективна при выработке майонезов. Этот продукт представляет собой водно-масляную эмульсию, содержащую много воздуха и обычно хранимую на свету, при комнатной температуре. Масло подвергается воздействию самых неблагоприятных факторов, быстро вызывающих порчу и прогоркание. Если из майонеза удалить кислород, введя в него 20-50 мг% препарата фермента, то срок хранения продукта резко возрастает и признаков прогорклости, изменений цвета или увеличения количеств перекисей не обнаруживается через 6 и даже 12 месяцев.

Большое внимание привлекло запатентованное в 70-х годах изобретение – деоксигенерирующие пакеты (удаляющие кислород). Их изготавливают из пленки, через которую проходит кислород или воздух, но не проникает вода, например из полиэтиленовой. В пакеты вносят глюкозу, соответствующий буферный раствор для поддержания реакции среды и ферменты – глюкооксидазу и каталазу. Затем их помещают в герметически закрытые контейнеры, банки или ящики, где находятся продукты, которые нужно защитить от окисления: жиры, пищевые концентраты, содержащие жир и др. Пакеты полностью поглощают кислород в контейнере и хранимые материалы далее находятся в бескислородной среде. Прекращается также доступ к продуктам новых порций кислорода из атмосферы.

Заметное практическое использование находят еще два негидролитических фермента – каталаза и пероксидаза.

Н₂О₂ каталаза О₂ + 2Н₂О

Каталаза окисляет саму Н₂О₂, некоторые спирты и не действует на большинство соединений, которые «подвластны» пероксидазе, эта последняя не окисляет Н₂О₂, но окисляет множество веществ – фенолы, амины, некоторые гетероциклические и многие другие вещества.

Известны два основных типа использования каталазы: прекращение действия перекиси водорода, точнее устранение ее избытка в системе, или получения из нее кислорода. Хотя перекись водорода в промышленности используется довольно широко, применение ее осложняется и всегда опасно из-за сильного действия этого вещества. Процесс использования Н₂О₂ всегда должен быть таким, чтобы остаток или избыток (по окончании действия) мог быть быстро и надежно удален. Для этой цели особенно удобным агентом является каталаза.

Остаток перекиси удаляется:

1. при отбеливании Н₂О₂ различных материалов;

2. при стерилизации молока и яичной массы;

Благодаря каталазе оказывается возможной холодная стерилизация молока при производстве сыра. Такая стерилизация производится действием Н₂О₂. При помощи фермента разрушают оставшийся вредный избыток перекиси водорода, и в молоке в дальнейшем может быть обеспечен рост необходимой для сыроварения культуры микроорганизмов, которую специально вводят после обработки молока.

Липоксидаза (липоксигеназа) катализирует окисление кислородом воздуха ненасыщенных жиров (жирных кислот) с образованием их пероксидов. Фермент действует специфично и присоединяет молекулу О₂ к двойным связям только в положении С₉-С₁₀ у ненасыщенных жирных кислот. Нужно, чтобы в молекуле жирной кислоты было не меньше двух двойных связей. Такому условию отвечают только три кислоты: линолевая, линоленовая, арахидоновая, которые, находясь в пищевых продуктах, окисляются наиболее легко. Только эти кислоты и окисляются липоксигеназой, причем образуются соответствующие перекиси. Реакция протекает по следующей схеме:

(6) (7) (8) (9) (10) (6) (7) (8) (9) (10)

- СН=СН-СН₂-СН=СН- + О₂ -СН=СН-СН₂-СН-СН-

О - О

При использовании липоксигеназа обладает положительным и отрицательным действием.

Положительное действие проявляется: а) в отбеливающем влиянии на тесто, улучшении свойств хлеба; б) в улучшении (на начальных этапах процесса) макаронных изделий, клейковины муки; в) в улучшении состояния кожи человеческого тела.

Отрицательное действие липоксигеназы выявляется в том, что катализируемые ею реакции окисления приводят к прогорканию и порче многих пищевых продуктов, в первую очередь муки и крупы, к потере каротина и витамина А в тех продуктах, где их желательно сохранить.

Гидроперекиси жирных кислот обладают способностью окислять каротиноиды, окрашивающие в желтый цвет муку и многие иные продукты; при этом образуются бесцветные вещества. Если липоксигеназа слабо подействовала на тесто и в нем образовалось небольшое количество перекисей, то последние укрепляют клейковину муки, улучшают ее физические свойства. На этом основан способ улучшения хлебопекарных качеств муки, основанный на том, что в тесто прибавляют небольшое количество соевой муки, богатой липоксигеназой, и некоторое количество растительного масла – субстрата окисления.

При окислении гидроперекисями жирных кислот образуются различные альдегиды и кетоны, они придают муке, крупе и др. пищевым продуктам неприятный вкус и запах. Бороться с данным процессом можно, уничтожая (инактивируя) соответствующие ферменты – липоксигеназу и липазу. В хлебопечении это производят обработкой муки горячим водяным паром – пропариванием.

Большое практическое значение имеют полифенолоксидазы и оксидаза аскорбиновой кислоты (аскорбинатоксидаза), которые, в первую очередь, влияют на внешний вид плодоовощного сырья и продуктов и вызывают их потемнение при хранении и технологической обработке. Наиболее характерным выявлением действия полифенолоксидазы является появление темной окраски на разрезе у сырого картофеля, яблок, лука. Из-за этого сушеный картофель (ломтики) или сушеные яблоки приобретают крайне непривлекательный вид. Макароны также могут сильно потемнеть, если активность фермента в муке была высокой.

Наоборот, в производстве черного чая дубильные вещества, которые в нем содержатся, вступают в контакт с ферментом и окисляются; при этом появляются соединения темного цвета, которые и определяют внешний вид черного чая.

Существуют различные способы предотвращения нежелательных процессов, катализируемых фенолоксидазами: физические и химические. Первые включают полное удаление кислорода из системы; инактивирование ферментов нагреванием (бланшировка от французского слова blanch-белый – кратковременное погружение в кипяток или обработка паром) или подкислением среды.

Химических способов известно больше: а) прибавление веществ, реагирующих с хинонами или иными промежуточными продуктами окисления и устраняющими полимеризацию их в окрашенные продукты (сульфит натрия, аскорбиновая кислота и другие восстановители); б) ингибирование действия ферментов добавлением конкурентных ингибиторов (нитрофенолов, бензойной и некоторых других ароматических кислот); в) блокирование меди в составе фермента; г) добавление веществ, которые реагируют не с ферментом, а с субстратом и образуют соединения, которые фермент не окисляет.

Наиболее распространенные способы борьбы с потемнением плодов и фруктов – это бланшировка или химическая обработка перед высушиванием бисульфитом натрия или сернистым газом (SO₂). Оба эти вещества образуют сернистую кислоту (Н₂SO₃), которая инактивирует фенолазу, будучи сильным восстановителем. Она обесцвечивает даже те окрашенные вещества (меланины), которые уже образовались. Все же использование сернистой кислоты имеет и отрицательные стороны, в частности, опасна возможность окисления ее в серную и затем образование сульфата натрия, который неблагоприятно влияет на желудочно-кишечный тракт ….

На практике в молочной промышленности ферментативные реакции используют не только для получения готовых продуктов, но и для контроля качества молока. Например, степень микробиологического загрязнения молока оценивают по редуктазной пробе. Редуктазу вырабатывают микроорганизмы, которые развиваются в молоке до его переработки. Чем больше в молоке м.о., тем больше соответствующего фермента, а редуктаза имеет способность обесцвечивать краситель метиленовый синий путем его восстановления. Таким образом, исследуемым путем установлена зависимость между м.о. в определенном объеме молока и временем обесцвечивания молока при добавлении метиленового синего.

Ферменты, как белковые соединения, при определенных высоких температурах инактивируются за счет коагуляции белковой части. Это свойство используют для определения эффективности пастеризации молока.

К гидролитическим ферментам, которые имеют значение в пищевых технологиях относятся ферменты пектолитического действия (протопектиназы, эндо-, экзополигалактуроназы, катализирующие расщепление пектиновых веществ плодов и овощей до соединений с меньшей молекулярной массой. Эти ферменты используют с целью размягчения растительных тканей для более полного выделения соков, а также в процессах осветления соков и вин. К гидролитическим ферментам относят также амилазы, липазы и др.

Во многих пищевых технологиях ферментативные процессы используют для экстрагирования. С помощью ферментов извлекают, например, полисахариды из отходов соковых производств. Роль таких ферментов в процессах экстракции сводится к расщеплению межмолекулярных связей между субстратом и другими компонентами сырья и внутримолекулярных связей. Последнее необходимо для того, чтобы интенсифицировать собственно экстракцию из сырья в жидкость.

Обычно промышленные ферментативные препараты не обладают каким-либо одним видом катализа, т.к. их вырабатывают на основе микробиологического синтеза, а микроорганизмы в процессе жизнедеятельности вырабатывают целый ряд ферментов.

Разделение одних ферментов от других является сложной задачей, поэтому ферменты с достаточно высокой активностью стоят дорого. Обычно в промышленности используют ферментные препараты, которые кроме коммерческого названия имеют буквенные обозначения. В буквенном названии кроме буквы, указывающей на класс, есть буква, обозначающая способ культивирования, а цифра означает степень очистки.

Например, П10 х; Г3 х

П рактически обработку жидких пищевых сред проводят в ферментаторах, которые представляют собой термоизолированную емкость, снабженную стальной рубашкой и мешалкой. В ферментаторе имеются патрубки для ввода жидкого продукта, буферных веществ и для выпуска готового продукта. Сущность ферментной обработки заключается в том, что к продукту добавляют небольшое количество ферментного препарата и если это необходимо буферные соли. Затем при перемешивании продукт выдерживают от 30 мин до нескольких часов. В конце обработки фермент инактивируют, чаще всего нагреванием. Продукт передают на дальнейшую обработку, а процесс повторяют для новой партии сырья, т.е. всякий раз используют все новое и новое количество ферментов. Кроме того, по такому способу обработки для осуществления непрерывности требуется большое число емкостей.

В производственных условиях используют сухие либо жидкие ферментные препараты. Жидкие представляют собой концентраты очищенных либо неочищенных водных растворов фермента с помощью центрифугирования или с помощью полимерных мембран, а сухие с помощью сублимационной сушки, сущность которой заключается в замораживании жидкого раствора с дальнейшей возгонкой льда, что позволяет переводить в пар минуя жидкость. В таких условиях активность ферментов хорошо сохраняется.

В последнее время с целью устранения вышеуказанных недостатков (длительность процесса, дороговизна ферментных препаратов и одноразовое использование, большое число ферментаторов), стали применять метод иммобилизации.

Иммобилизованные ферменты или ферменты пролонгированного действия представляют собой, более ли менее чистые ферментные препараты или даже колонии микроорганизмов, которые четко зафиксированы, связаны на различных носителях.

Сущность иммобилизации ферментов – прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе, заключение в гель или в полупроницаемую мембранную систему.

Для иммобилизации используют неорганические и органические носители, к которым предъявляются следующие требования:

1. нерастворимость носителя в обрабатываемой среде;

2. отличие по электрическому заряду от заряженных ферментов;

3. высокая химическая, биологическая и механическая устойчивость;

4. отсутствие неспецифического действия на субстрат (адсорбции);

5. высокая гидрофильность;

6. легкая обработка носителя для производства различных насадок (грану, колец и т.д.).

Среди органических носителей используют полиэтилен, полипропилен, фенолформальдегидные смолы и некоторые полисахариды (декстрины, целлюлозу). В некоторых случаях используют неорганические носители в виде селикогеля, асбеста, оксиды металлов. Все эти соединения обрабатываются специальным методом, чтобы придать большую площадь контакта иммобилизованного фермента и субстрата. Носители иммобилизованных ферментов называют матрицами. Их изготавливают в виде гранул, колец, конусов и помещают в специальные термоизолированные колонки, в которых необходимо поддерживать температуру, и если необходимо, соответствующую рН. Ферменты фиксируют на носителях физическими или химическими способами.

Все способы иммобилизации делят на:

1. физические

2. химические

В большинстве случаев в промышленных масштабах используют химическую иммобилизацию, т.к. она более эффективна при грануляции, нежели физическая иммобилизация. Она заключается в связывании ферментов за счет ковалентных связей. Химическая связь дает более стабильные результаты, однако, при этом утрачивается активность ферментов.

Между тем иммобилизованные ферменты легко отделить от продукта, они удобны при применении, их можно многократного использовать, фермент не загрязняет продукт. При иммобилизации представляется возможным менять и целенаправленно модифицировать свойства фермента. Наконец, иммобилизованные ферменты обычно более стабильны к действию температуры и рН среды.

Этот способ более выгоден, чем периодический метод.

У становка на иммобилизованных ферментах имеет следующий вид:

1. емкость для поступающего продукта

2. насос

3. вентиль

4. ферментативные колонки, объединенные

в батареи

5. емкость для конечного продукта

Если по периодическому способу каждая обработка новым ферментом другого действия требует других условий растворения, то с помощью колонок можно одно и тоже вещество обрабатывать разными ферментами непрерывно в потоке. При соответствующем открытии, закрытии вентилей можно организовать или параллельную или последовательную циркуляцию, а также выключение соответствующих колонок с целью их санитарной обработки.

Области применения иммобилизованных ферментов

Пищевая и фармацевтическая промышленность	Производство фруктозной патоки из глюкозы на основе иммобилизованной глюкозоизомеразы; Производство D-фруктозы из D-глюкозы на основе иммобилизованной пиранозо-2-оксидазы; Получение L-аминокислот из рацемата с использованием аминоацилазы; Получение 6-аминопенициллановой кислоты на основе иммобилизованной пенициллинамидазы
Медицина	Создание лекарств пролонгированного действия со сниженной аллергенностью и токсичностью

Применяют также при органическом синтезе, в аналитических исследованиях, в бессеребряных фотографиях и т.д.