Занятие № 6. «Ферментативный катализ»

Цель занятия: изучить метод количественного определения активности ферментов.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Методы определения ферментативной активности. Единицы измерения активности и количества фермента.

2. Механизмы регуляции ферментативной активности.

3. Коферменты, образующиеся из витаминов В₁, Н. Механизм действия ферментов карбоксилирования и декарбоксилирования.

4. Коферменты, образующиеся из витаминов В₂, В₅, липоевая кислота и их биохимическая роль. Механизм действия окислительно-восстановительных ферментов (оксидоредуктаз).

5. Коферменты, образующиеся из витаминов В₃, В₁₂, В₆, Вс и их биохимическая роль. Механизм действия ферментов трансфераз.

Дата выполнения ________ Балл ____ Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа.

Опыт 1. Определение активности пероксидазы.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Водяная баня.

4. Колба, 200 мл.

5. Весы аналитические.

6. Секундомер.

7. Водяная баня.

8. Ступка с пестиком.

9. Фильтры бумажные.

10. Стеклянная воронка.

11. ФЭК, кюветы 1 см.

Реактивы. 1. Растительный материал.

2. Пероксид водорода, 0,3%-ный раствор.

3. Дистиллированная вода.

4. Уксусная кислота, ледяная.

5. Бензидин, кристаллический.

6. Ацетат натрия, кристаллический.

Приготовление раствора бензидина:

В мерную колбу на 200 мл, наполненную на 2/3 дистиллированной водой, прибавляют 2-3 мл ледяной уксусной кислоты и 184 мг бензидина. Колбу нагревают на водяной бане до 60°С при постоянном взбалтывании. После растворения бензидина в колбу добавляют 5,45 г уксуснокислого натрия. После его растворения колбу охлаждают и доливают водой до метки.

Ход опыта:

1. Навеску растительного материала (50-100 мг) разотрите в ступке с водой, перенесите в мерную колбу на 25 мл и доведите дистиллированной водой до метки.

2. Растительную вытяжку настаивайте в течение 5-10 минут, а затем центрифугируйте в течение 10 минут при 3000 об./мин (центрифугирование можно заменить фильтрованием).

3. Фильтрат или надосадочную жидкость используют для определения пероксидазной активности.

4. Для определения активности фермента возьмите две кюветы толщиной 1 см.

5. По первой кювете (контроль) установите ноль прибора (ФЭК), регулируя переключатели «чувствительность» (1, 2, 3) и «установка нуля».

6. В контрольную кювету поместите 2 мл бензидина, 2 мл фильтрата и 2 мл воды. Стрелка прибора должна находиться в положении «0». Определение проводят с красным светофильтром при длине волны λ = 670нм.

7. Во вторую кювету (опыт) налейте 2 мл бензидина, 2 мл фильтрата и 2 мл 0,3%-ного раствора пероксида водорода, при этом сильная струя перекиси перемешивает содержимое кюветы. Добавление H₂О₂ служит стартом реакции.

8. Одновременно с вливанием пероксида водорода включите секундомер. В опытной кювете раствор синеет, стрелка прибора передвигается справа налево. Отмечают время, за которое стрелка достигает 0,2 делений прибора (ед. оптической плотности). Это время должно находиться в пределах от 20 до 50 секунд.

9. Если активность фермента низкая, то есть стрелка прибора достигает значений 0,2 за более длительное время (более 1-2 мин), тогда можно вести отсчет до 0,1 ед. оптической плотности.

10. Если активность фермента высокая, тогда следует разбавить вытяжку. В этом случае в кювету вливают не 2 мл фильтрата, а 1 мл и добавляют 1 мл воды.

11. Активность пероксидазы рассчитывают по формуле:

где D – оптическая плотность (0,1–0,2);

Е – разведение (перерасчет на 1 г сырой массы);

t – время, с;

d – толщина слоя жидкости, толщина кюветы (1 см).

Активность пероксидазы выражают в единицах оптической плотности на грамм сырой массы в секунду (∆D₆₇₀Г^-1·с^-1).

Пример расчета разведения.

Для опыта была взята навеска 100 мг или 0,1 г, которую перенесли в колбу на 25 мл. Непосредственно для определения активности фермента было взято 2 мл вытяжки, что соответствует 25 : 2 = 12,5 частей всей вытяжки или 100 : 12,5 = 8 мг навески. Данная вытяжка имеет определенную ферментативную активность «а», тогда составляется пропорция:

8 мг - а

1000 мг (1 г) - х

Таким образом, в данном случае в формулу вместо Е ставится 125.

Рассчитайте и запишите полученной Вами значение. Сравните Ваши результаты с результатами студентов Вашей группы. К какому классу ферментов относится пероксидаза? Какие функции на неё возложены в растительной клетке?