Занятие № 4. «Строение и физико-химические свойства аминокислот и белков»

Цель занятия: cформировать знания о физико-химических свойствах аминокислот и белка. Обучить методике выполнения цветных реакций на белки и аминокислоты. Провести реакции осаждения белка и объяснять их механизмы. Сформировать знания о структурной организации белков.

ВОПРОСЫ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ:

1. Природные аминокислоты. Строение и классификация.

2. Природные аминокислоты. Биологическое значение и функции.

3. Охарактеризуйте уровни организации белковой молекулы и химические связи их стабилизирующие.

4. Классификация белков. Функции белков различных классов в осуществлении биохимических реакций.

5. Физико-химические свойства аминокислот и белков. Изоэлектрическая точка и состояние. Раскройте важность амфотерной природы аминокислот и белков в биологическом отношении.

6. Денатурация и ренатурация белков.

Дата выполнения______ Балл _____Подпись преподавателя ____________

Экспериментальная работа. Получение вытяжки белка

1. 5 г гороховой муки насыпьте в колбочку и залейте 30 мл 10%-ного раствора сернокислого аммония.

2. Колбочку встряхивайте в течение 3-х минут.

3. Затем дайте отстояться раствору и его верхний слой профильтруйте, предварительно смочив фильтр тем же раствором сернокислого аммония.

4. Полученный фильтрат используйте в нижеприведенных опытах.

Опыт 1. Обнаружение ароматических и гетероциклических аминокислот (ксантопротеиновая реакция).

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Водяная баня, кипящая.

4. Газовая горелка.

Реактивы. 1. Тирозин, 1%-ный раствор.

2. Глицин, 1%-ный раствор.

3. Раствор белка.

4. Азотная кислота, концентрированная.

5. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор.

1. Возьмите три пробирки.

2. В первую пробирку налейте 0,5 мл 1%-ного раствора тирозина, во 2-ю 0,5 мл 1%-ного раствора глицина, в 3-ю - 0,5 мл раствора белка.

3. В каждую пробирку добавьте по 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно (!) кипятите в водяной бане.

4. После охлаждения пробирок до комнатной температуры в каждую из них добавьте по 0,5 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия.

Объясните результаты опыта. Какой структурный фрагмент молекулы -аминокислоты выявляется с помощью ксантопротеиновой реакции? В какой из пробирок появилось оранжевой окрашивание после добавления NaOH и почему?

Опыт 2. Обнаружение аминокислот, содержащих слабосвязанную серу (реакция Фоля).

Приборы: 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Газовая горелка.

4. Держатель для пробирок.

Реактивы: 1. Раствор белка.

2. Желатин, 1%-ный раствор.

3. Гидроксид натрия, 30%-ный раствор.

4. Ацетат свинца, 5%-ный раствор.

1. В пробирку налейте 1 мл раствора белка.

2. Добавьте 1 мл 30%-ного раствора гидроксида натрия и 3-4 капли 5%-ного раствора ацетата свинца.

3. Нагрейте пробирку до кипения в водяной бане в течении 0,5 минуты.

4. Повторите пункт 1-3 с 1%-ным раствором желатина.

Объясните результаты опыта.

Опыт 3. Обнаружение триптофана (реакция Адамкевича).

При действии на белок глиоксиловой кислоты в присутствии концентрированной серной кислоты получается красно-фиолетовое окрашивание раствора, связанное с присутствием в белке триптофана.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Раствор белка.

2. Уксуная кислота, концентрированная.

3. Серная кислота, концентрированная.

1. Налейте в пробирку 0,5 мл раствора белка и прибавьте 1 мл концентрированной уксусной кислоты, которая всегда содержит в качестве примеси глиоксиловую кислоту.

2. Сильно наклоните пробирку и осторожно по стенке влейте в нее 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы жидкости не смешались.

3. Появление красно-фиолетового кольца на границе кислот, свидетельствует о положительной реакции.

Напишите формулу триптофана.

Опыт 4. Обнаружение пептидной группы (биуретовая реакция).

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

Реактивы. 1. Глицин, 1%-ный раствор.

2. Раствор белка.

3. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор.

4. Сульфат меди, 2%-ный раствор.

1. Возьмите две пробирки.

2. В 1-ю пробирку налейте 0,5 мл 1%-ного раствора глицина, во 2-ю – 0,5 мл раствора белка.

3. В каждую пробирку добавьте по 0,5 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия, а затем по 2-3 капли 2%-ного раствора сульфата меди (II).

В какой из пробирок появляется сине-фиолетовое окрашивание и почему? Напишите реакцию образования пептидной связи между двумя аминокислотами.

Опыт 5. Реакции осаждения белков.

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Стеклянная палочка.

4. Водяная баня, кипящая.

Реактивы. 1. Раствор белка.

2. Гидроксид натрия, 10%-ный раствор.

3. Ацетон.

4. Сульфат аммония, насыщенный раствор.

5. Дистиллированная вода.

6. Уксусная кислота, 1%-ный раствор.

7. Уксусная кислота, 10%-ный раствор.

8. Трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор.

9. Ацетат свинца, 5%-ный раствор.

а) Обратимое осаждение белков сернокислым аммонием (высаливание).

1. В пробирку налейте 0,5 мл раствора белка.

2. Добавьте 1 мл насыщенного раствора сернокислого аммония.

Объясните причину выпадения осадка.

3. К раствору с осадком белков добавьте равный объем дистиллированной воды, хорошо перемешайте.

Почему наблюдается постепенное исчезновение осадка белков?

б) Осаждение белков при кипячении.

1. Возьмите четыре пробирки.

2. В каждую налейте по 0,5 мл раствора белка.

3. Первую пробирку оставьте без изменений, во 2-ю добавьте 1 каплю 1%-ной уксусной кислоты, в 3-ю – 5 капель 10%-ной уксусной кислоты, в 4-ю – 5 капель 10% гидроксида натрия.

4. Содержимое всех пробирок перемешайте и поставьте на 5 мин в кипящую водяную баню.

5. Сравните характер изменения растворов при нагревании.

Запишите в таблицу результаты осаждения белков при кипячении в различных средах (отметьте положительный результат осаждения плюсом, а отрицательный  минусом) и укажите в каждом случае причины появления или отсутствия осадка белка.

	Нейтральная среда	Слабокислая среда	Сильнокислая среда	Щелочная среда
Результат осаждения
Причина

в) Осаждение белков солями тяжелых металлов, концентрированными минеральными кислотами, органическими растворителями.

1. Возьмите три пробирки.

2. В каждую налейте по 0,5 мл раствора белка.

3. В первую пробирку добавьте 2 капли 5%-ного раствора уксуснокислого свинца, во 2-ю – 2 капли 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), в 3-ю – 1 мл ацетона.

Результаты реакций осаждения белков запишите в таблицу:

Название веществ, осаждающих белки	Характер и цвет осадка	Чем обусловлена реакция и ее особенности

Опыт 6. Определение изоэлектрической точки белка (демонстрационный).

Приборы. 1. Штатив с пробирками.

2. Набор пипеток.

3. Стеклянная палочка.

Реактивы. 1. Дигидрофосфат калия, 0,2 М раствор.

2. Лимонная кислота, 0,1 М раствор.

3. Желатин, порошок.

1. Возьмите 7 пробирок одинакового диаметра.

2. Насыпьте в каждую пробирку меркой равное количество измельченного в порошок желатина.

3. Прилейте в каждую пробирку по 10 мл буферного раствора с определенной величиной рН (см. таблицу).

рН буферного раствора	2	3	4	5	6	7	8
0,2 М р-р КН2РО4 (мл)	–	2	4	5	7	8	10
0,1 М р-р лимонной к-ты (мл)	10	8	6	5	3	2	–

Через 15-20 мин измерьте высоту каждого столбика набухшего желатина. Постройте график зависимости степени набухания от величины рН и определите изоэлектрическую точку желатина (рI).

Дата выполнения _______Балл _______Подпись преподавателя ____________