1.5. Відповідь рослин на стрес

Біотичні (патогени) та абіотичні (температура, освітлення, хімічні речовини та ін.) фактори зовнішнього середовища можуть негативно впливати на рослинний організм. У відповідь на дію стресових факторів у рослин відбувається підвищеня стаціонарного рівня активованих форм кисню. Для адаптації рослин до цього підвищення відбувається активація антиоксидантної системи.

1.5.1. Сольовий стрес

Засолення ґрунтів є важливою глобальною проблемою сільського господарства. Засолено більше 20% зрошуваних полів світу, де вирощують одну третину світових продуктів харчування [FAO, 2007]. Вплив засолення на ріст та розвиток рослин відбувається двома шляхами. По-перше, засолення викликає осмотичний стрес через зменшення надходження води в рослину у зв’язку зі зниженням водного потенціалу ґрунту. По-друге, це призводить до надмірного потрапляння іонів Na⁺ та Cl^- в організм рослин, і, як наслідок, різних змін метаболічних процесів. Відповідь рослин на осмотичні та іонні складові залежить, головним чином, від природної солестійкості рослин, інтенсивності сольового стресу (концентрації солі у ґрунті) та від тривалості сольової експозиції коренів рослини [Hasegawa et al., 2000, Munns and Tester, 2008, Zhu, 2002]. У зв’язку з цим відповідь рослин на сольовий стрес може призводити до різного рівня адаптації від продовження росту рослин, через зміну швидкості росту, до адаптації для виживання, коли ріст рослини практично призупинений, але рослина залишається живою до закінчення дії стресу. Необхідність протидіяти сольовому стресу може призводити до прискореного старіння або навіть до загибелі рослини.

Основними процесами, які ведуть до адаптації рослини за дії сольового стресу, включають контроль втрати води через продихи, метаболічні перебудови, регуляцію іонного та осмотичного гомеостазу [Hasegawa et al., 2000, Munns and Tester, 2008]. При порушенні осмотичного та іонного балансу зростає кількість активованих форм кисню, які призводять до виникнення вторинного оксидативного стресу. Для попередження негативної дії останнього існує досить складна багаторівнева антиоксидантна система, яка попереджує розвиток окисного стресу внаслідок дії на рослини високих концентрацій солей. Детоксифікація АФК з одного боку розглядається як найважливіший компонент солестійкості рослин, показаної при дослідженнях мутантних та трансгенних рослин з підвищеною здатністю до знешкодження АФК [Hasegawa et al., 2000]. З іншого боку, було висловлене припущення, що введення генетичних мутацій, які допомагають рослинному організму активніше знешкоджувати АФК, не завжди покращують солестійкість рослин [Munns and Tester, 2008]. Це припущення було підтверджене дослідженнями, які показали, що мутантні лінії арабідопсису, у яких була відсутня аскорбатпероксидаза в цитозолі і/або хлоропластах, були більш солестійкі, ніж рослини вихідної лінії [Miller et al., 2007]. Більш детальне вивчення наявної інформації, зокрема, нові дані про утворення та розпад АФК за дії сольового стресу допоможуть пояснити цей парадокс.

Відповідь рослин на дію сольового стресу також залежить від їхнього типу фотосинтезу. У зелених рослин виділяють три типи фотосинтезу: С3, С4 та САМ (метаболізм карбонових кислот на зразок товстянкових).

У рослин С3, атмосферний вуглекислий газ фіксується безпосередньо Рубіско (Rubisco – рибулозо 1,5-бісфосфат карбоксилаз оксигеназа) на 5-вуглицеві фосфовуглеводи для подальшого їх перетворення в 3-вуглецеві сполуки. У рослин С4 та САМ атмосферний вуглекислий газ фіксується на 3-вуглецеві сполуки за допомогою фосфоенолпіруваткарбоксилази з подальшим їх перетворенням до 4-вуглецевих сполук, які декарбоксилюються з вивільненням CO₂ в безпосередній близькості до Рубіско, цим самим концентруючи CO₂ та знижуючи рівень оксигеназних реакцій. У С4 рослин фіксація атмосферного CO₂ відбувається в мезофілі листка та його подальшого вивільненя під дією Рубіско на поверхню клітини, тоді як ці дві реакції у САМ рослин розділені в часі (день і ніч відповідно).

Спочатку дія сольового стресу викликає підвищення генерації АФК у рослин. По-перше, рослини реагують на сольовий стрес зменшуючи активність продихів для попередження надмірної втрати води. Це, в свою чергу, зменшує внутрішню концентрацію CO₂ та сповільнює його розщеплення в циклі Кальвіна. Ця реакція призводить до виснаження окисленого НАДФ⁺, який діє кінцевим акцептором фотосистеми І, та підвищує потік електронів на O₂ для формування супероксид аніону O₂^•− [Hsu and Kao, 2003]. Окрім того, Na⁺/Cl^- токсичний вплив сольового стресу може порушити функціонування фотосинтетичного апарату рослин [Gossett et al., 1994, Borsani et al., 2001, Slesak et al., 2002]. По-друге, зниження внутрішньоклітинної концентрації CO₂ сповільнює реакції циклу Кальвіна та стимулює фотореспірацію, особливо, у С3 рослин, в результаті чого підвищується генерація пероксиду водню в пероксисомах [Leegood et al., 1995, Wingler et al., 2000, Ghannoum, 2009]. По-третє, НАДФН-оксидаза, зв’язана з клітинною мембраною, та апопластична диаміноксидаза можуть бути активовані за дії сольового стресу, що крім того, сприяє генерації АФК [Cross et al., 1993, Hernandez et al., 2001, Lin and Kao, 2001, Mazel et al., 2004, Tsai et al., 2005]. По-четверте, сольовий стрес збільшує швидкість дихання, що призводить до витоку електронів дихального ланцюга до O₂ з утворенням O₂^•− [Fry et al., 1986, Moser et al., 1991, Jeanjean et al., 1993]. Практично, неможливо визначити внесок кожного з вказаних вище джерел генерації АФК за дії сольового стресу. Тим не менш, фотореспірація сильно стимулюється сольовим стресом в C3, але не в С4 і CAM рослин [Cushman et al., 1997] Було підраховано, що на фотодихання припадає понад 70% вивільненого H₂O₂ при осмотичному стресі [Noctor et al., 2002]. Це означає, що фотодихання є основним джерелом АФК під час сольового стресу.

Експериментальні дані по стійкості до оксидативного стресу пшениці (С3) та кукурудзи (С4) показали, що кукурудза менше «страждає» від оксидативного стресу за дії сольового стресу [Stepien and Klobus, 2005]. У цьому дослідженні було показано, що сортові відмінності в чутливості до окисного стресу спостерігалися в пшениці, але не в кукурудзі, і дані не показали притаманної солестійкості вивчених сортів (ріст в умовах сольового стресу). Більше того, активність конституційних та стрес-індукованих ферментів, зокрема, супероксиддисмутази, аскорбатпероксидази та глютатіонредуктази, була вищою в проростках кукурудзи. Тому вражають, що висока стійкість кукурудзи до стресу по суті пов’язана зі зниженням утворення АФК (можливо через фотосинтез С4), або за рахунок активації антиоксидантних ферментів. Немає підстав вважати, що вища активність антиоксидантних ферментів в кукурудзі нерозривно пов’язана з С4 фотосинтезом. У порівняльному дослідженні соняшника (С3) та кукурудзи (С4) було показано, що активність супероксиддисмутази, глютатіонредуктази, неспецифічної пероксидази та каталази була вищою у листках соняшнику при експозиції до 100 мМ NaCl [Rios-Gonzalez et al., 2002]. Однак, така висока активність не може бути суттєвою при сольовому стресі, а, ймовірніше, причиною є висока конституційна активність та джерело азоту. Жодної зміни в активності антиоксидантних ферментів коренів не спостерігалось в обох рослинах. Ростові параметри показали, що соняшник був більш солестійкий, ніж кукурудза. Також висока активність антиоксидантних ферментів соняшника корелювала з вищою солестійкістю, однак, неясно наскільки ця активність сприяє солестійкості, оскільки немає даних про утворення АФК в умовах сольового стресу у цієї рослини. Недостатня кількість даних про утворення та елімінацію АФК в С3 та С4 рослинах не дозволяє зробити однозначний висновок про роль антиоксидантного захисту за дії сольового стресу в обох групах рослин. Отже, роль фотодихання в генерації АФК в С3 та С4 рослинах в умовах сольового стресу має бути досліджено та перевірено детельніше.

Також показано, що САМ метаболізм може бути більш ефективним у зниженні АФК рівня за дії стресу, зумовленого засоленням, в порівнянні з С3 та С4 метаболізмами. Це може бути пояснено тим, що САМ метаболізм є основним та адаптований до низької доступності води, а також низької концентрації клітинного CO₂. Це відмінне від С4 метаболізму, але, водночас, якщо рослина продовжує втрачати воду, то вона в кінцевому підсумку закриває продихи. На даний момент не показано переваг С4 метаболізму над С3 з точки зору генерації АФК [Abogadallah, 2010].

1.6.2. Вплив донорів оксиду азоту на рослинний організм

Головною метою при дослідженнях з використанням донорів оксиду азоту є можлива роль ^•NO у рості та розвитку рослин, його участь у механізмах передачі сигналів та відповіді рослин на стресові ситуації [Beligni and Lamattina, 2001].

Метаболізм рослин досить чутливий до оксиду азоту (^•NO), і, як наслідок, багато досліджень сфокусовані саме на вивченні впливу ^•NO на фізіологічний стан рослин. Участь ^•NO у названих процесах, зазвичай, вивчають шляхом екзогенного додавання донорів ^•NO у широкому діапазоні концентрацій і різноманітих рослин. Донори використовуються найчастіше у формі, яка вивільняє ^•NO в середовище. У зв’язку з цим, концентрація ^•NO всередині тканин рослини залежить від багатьох факторів, таких, як тип рослин та їх фізіологічний стан, від кінетики вивільнення ^•NO з донорів, температури та особливостей хімічних перетворень [Tanno et al., 1996; Ramamurthi and Lewis, 1997]. Визначення концентрації ^•NO в тканинах є методичо досить складне. При екзогенному додаванні ^•NO важко визначити чи ефект є дійсно фізіологічним результатом, чи лише фармакологічним. Однак, це може дати перші припущення, які можуть бути потім порівняні з іншими дослідженнями.

При швидкому рості листків гороху, оброблених сумішшю KNO₂ та KI/H₂SO₄ було отримано неоднозначні результати [Leshem and Haramaty, 1996]. Низькі мікромомолярні концентрації ^•NO (5×10^-6 М) призводили до зростання швидкості розвитку листків, в той час як високі концентрації (12·5×10^-6 м) не впливали на даний показник. Наномолярні та мікромолярні концентрації ^•NO донорів (нітропрусиду натрію (НПН), S-нітрозоглютатіону та S-нітрозоцистеїну) пришвидшували видовження сегментів коренів кукурудзи в такий же мірі, або навіть більше, ніж така ж концентрація індолоцтової кислоти (ІОК), яка є гормоном (стимулятором) росту [Gouvêa et al., 1997].

Вплив вивільнених ^•NO-продуктів знижувався при додаванні метиленового синього (знешкоджує ^•NO), який додавали разом з донорами ^•NO, в результаті чого не спостерігалось елонгації коренів, спричиненої ІОК. Автори прийшли до висновку, що є певний взаємозв’язок між ^•NO і ІОК та їх вплив на елонгацію коренів Paulownia tormentosa [Gouvêa et al., 1997].

Подібні результати були отримані Ribeiro і колегами [Ribeiro et al., 1999], коли використовували анти-NOS (NO-синтази) антитіла (білок), виявлені в цитозолі активних зон поділу клітин кукурудзи. Більше того, при перенесенні цього білка в ядро зони елонгації коренів кукурудзи, було показано можливу участь ^•NO в активації транскрипційних факторів, залучених в експресії генів, які регулюють швидкий ріст зони елонгації (видовження) [Ribeiro et al., 1999]. Проте, ці результати неоднозначні, оскільки й досі не доведено присутність NO-синтази у рослин.

Був вивчений ефект ^•NO на пероксидази (гемвмісні ферменти), які беруть участь у лігніфікації судин ксилеми. Так, 5 мМ НПН призводив до інгібування активності гваяколпероксидази на 42-62%. Однак це не впливало на біосинтез лігніну [Ferrer and Ros Barceló, 1999].

Оксид азоту призводив до стимуляції проростання насіння Paulownia tormentosa. Нітропрусид натрію та інші органічні і неорганічні нітрати (оптимальна концентрація 1-10 мМ) стимулювали проростання насіння з однаковою ефективністю [Grubišic and Konjevic, 1990; Grubišic et al., 1992]. В результаті автори прийшли до висновку, що ефект нітратних складових залежав від їх здатності вивільняти ^•NO та призводити до змін редокс статусу, які були тісно пов’язані із виведенням насінин зі стану спокою. Стимуляція проростання насіння за дії ^•NO та світла була виявлена на насінні салату латук (Lactuca sativa L.) [Beligni and Lamattina, 2000]. У цій же роботі було показано, що ^•NO призводив до зростання концентрації хлорофілу у проростках пшениці, вирощеної в темряві. Короткотермінова дія світла (білого та червоного спектрів) призводила до дво- або трикратного зростання концентрації хлорофілів у листках проростків, оброблених донорами ^•NO у порівнянні до контрольних (оброблених водою) проростків. Ще більша різниця була отримана за дії додаткових стресових біотичних (інфікування Septoria tritici) та абіотичних (механічні пошкодження) факторів, що показало можливий зв'язок між ^•NO, світлом та шляхом проведення сигналів за умов стресу [Beligni and Lamattina, 2000]. У рослин трьох різних видів (Arabidopsis thaliana L. cv Columbia, Lactuca sativa L. cv Grand Rapids and Solanum tuberosum L. cv Pampeana), вирощених в темряві або при низькоінтенсивному освітленні, додавання наномолярних концентрацій ^•NO призводило до достовірного сповільнення видовження гіпокотилю та міжвузлів [Beligni and Lamattina, 2000].