1.3. Окисна та нітрозитивна модифікація білків

Найбільш реакційноздатним представником АФК є гідроксильний радикал HO^•, який має високий окислювальний потенціал. Його взаємодія з білками призводить до їхнього неспецифічного окислення, в той час як всі інші АФК мають нижчу здатність окислювати білки і реагують більш специфічно [Davies, 2005]. По відношенню до оксиду азоту, найбільш важливим фізіологічним фактором вважається окислення місць та просторового розподілу їх формування, потік та тривалість їх утворення. Фактично, різний вплив ^•NO залежить від місця його утворення та відстані, яку він встигає подолати. В місцях, де постійно вивільняється багато ^•NO переважає його опосередкований вплив. В результаті взаємодії ^•NO з киснем та супероксидом утворюються інші активні форми азоту. Найбільш реакційно здатним видом АФА є пероксинітрит (ONOO^-) [Halliwell and Gutteridge, 2007].

В живих організмах переважна більшість АФК взаємодіє з різними молекулами і утворює вторинні продукти. Окислення клітинних компонентів призводить до зміни їх властивостей. В результаті взаємодії білків з АФК відбувається розрив поліпептидного ланцюга, а також окислення бокових частин амінокислотних залишків.

При взаємодії активних форм зі складними білками розрізняють різні хімічні модифікації поліпептидного ланцюга та небілкового компонента. В свою чергу, зміна структури білкової частини може стосуватись як ділянок пептидного ланцюга, так і бокових частин амінокислотних залишків.

Практично всі амінокислотні залишки можуть окислюватись гідроксильним радикалом. У таблиці 1.3 [Лущак, 2007] наведена природа утворених продуктів в результаті окисної модифікації амінокислотних залишків.

Таблиця 1.3

Ідентифіковані продукти вільнорадикального окислення амінокислотних залишків білків [Лущак, 2007].

Амінокислотний залишок	Продукти
Фенілаланін	2,3-дигідроксифенілаланін 2-,3-, та 4-гідроксифенілаланін
Тирозин	3,4-дигідроксифенілаланін, дитирозин (2,2'-біфеніл-похідні), 3-нітротирозин, хлортирозин
Триптофан	кінуренін, 3-гідроксикінуренін, гідропіроліндол, оксиіндол, 3-гідроксилкінуренін, N-формілкінуренін
Гістидин	2-оксогістидин, 4-ОН-глутамат, аспартат, аспарагін
Лізин	2-аміноадипіновий напівальдегід
Аргінін	глутаміновий напівальдегід
Пролін	глутаміновий напівальдегід
Треонін	2-аміно-3-кетобутилова кислота
Глютамінова кислота	піровиноградна кислота
Аспарагінова кислота	піровиноградна кислота
Цистеїн	нітрозотиїли, тіолові радикали, цистин, кон’югати з глютатіоном
Метіонін	метіонінсульфоксид, метіонінсульфон

У таблиці 1.3. можна виділити наступні групи амінокислот (АК): ароматичні, АК, при окисленні яких утворюються карбоксильні групи, та сірковмісні АК. Залишки ароматичних АК найбільш чутливі до окислення АФК. За цих умов, фенілаланін може перетворюватись в моно- та дигідропохідні, а тирозин – в 3,4-дигідроксипохідне. Ці речовини можуть піддаватись окисленню/відновленню та генерувати АФК. Радикали, які утворюються при окисленні тирозину, можуть взаємодіяти між собою з утворенням дитирозинів, що може призводити до утворення внутрішньо- та міжмолекулярних зшивок пептидів. Тому наявність 2,2'-дифенільних похідних вважається надійним маркером пошкодження білків активними формами кисню [Schuessler and Schilling, 1984].

Взаємодія АФА та хлору з тирозиновими залишками може бути причиною утворення відповідно нітро- та хлорпохідних. Триптофан чутливий до γ-радіації – опромінення призводить до утворення різних гідроксипохідних, формілкінуренінів та 3-гідроксикінуренінів. При опроміненні УФ-променями, в присутності озону, Fe²⁺ та Н₂О₂, а також пероксинітриту, триптофан може перетворюватись в кінуренін та N-формілкінуренін. Водночас відомо, що тирозин та триптофан не є основними мішенями для окислення в системах з фізіологічними концентраціями перехідних металів. Це пов’язують з тим, що залишки названих амінокислот, зазвичай, відсутні в ділянках зв’язування даних іонів. На відміну від залишків тирозину та триптофану, залишки гістидину, аргініну та лізину особливо чутливі до АФК, які генеруються в системах, до складу яких входять катіони зі змінною валентністю. Залишки названих амінокислот знаходяться в місцях зв’язування іонів перехідних металів, і саме вони часто задіяні в утворенні коориданаційних зв’язків між ними [Stadtman, 1993, Dean et al., 1997].

Особлива увага приділяється утворенню додаткових карбонільних груп, які є маркерами окисних процесів організмів. Функціональні наслідки окисної модифікації білків залежать від природи АФК та самого білку, а також від конкретних місць та умов їх взаємодії. З таблиці 1.3. видно, що дані групи утворюються при окисленні лізину, аргініну, гістидину, проліну, треоніну, глютамінової та аспарагінової кислот. Окислення залишків перших чотирьох амінокислот призводить до утворення альдегідних та кетонових похідних (Рис. 1.2), а двох останніх – до розриву поліпептидного ланцюга з утворенням пірувільної групи з N-кінцевої амінокислоти [Лущак, 2007, Stadtman and Levine, 2003].

Утворення альдегідних та кетонових похідних лізину, аргініну, гістидину, проліну призводить до їх інактивації, перехресного зв’язування та руйнування білків [Levine and Stadtman, 2001; Dalle-Donne et al., 2003; Davies, 2005]. Багато карбонільованих білків було виявлено в матриксі мітохондрій: 20 з яких були карбонільовані in vivo, а пізніше 31 - in vitro при обробці гідроксильним радикалом [Kristensen et al., 2004].

Рис.1.2. Утворення карбонільних груп в бічних ланцюгах деяких амінокислот за дії різних окисників [Лущак, 2007, Stadtman and Levine, 2003].

Немає даних, які би вказували на можливість декарболювання білків [Shacter, 2000]. В рослинах Arabidopsis thaliana було показано, що відсоток карбонільованих білків від загальної їх кількості зростає протягом вегетативної стадії, але різко знижується на початку репродуктивної фази, залишаючись відносно низьким до та протягом старіння. Було припущено, що низький рівень карбонільованих білків протягом репродуктивної фази у рослин може бути частиною стратегії для обмеження потрапляння пошкоджених окисленням компонентів до наступного покоління [Johansonn et al., 2004]. У листках пшениці концентрація карбонільних груп білків була вищою у мітохондріях, ніж у хлоропластах та пероксисомах [Bartoli et al., 2004]. Це свідчить про вищу чутливість мітохондрій до окисних пошкоджень і/або гіршу здатність знешкоджувати модифіковані білки в мітохондріях.

Залишки цистеїну та метіоніну в білках особливо чутливі до окислення всіма активними формами кисню, азоту, сірки та хлору. При окисленні залишків цистеїну послідовно утворюються похідні сульфенової, сульфінової та сульфонової кислот. Залишки метіоніну також можуть піддаватись зворотному окисленню з наступним утворенням метіонінсульфоксиду та метіонінсульфону. Метіонінсульфоксид може відновлюватись до метіоніну [Levine et al., 2000].