Висновки

1. Концентрація всіх пігментів зростала при 24 год експозиції проростків кукурудзи до 100 мМ NaCl, що може бути неспецифічною реакцією адаптації в умовах дії стресового фактору. Проте, за додавання 0,2 мМ НПН у середовище такий ефект не спостерігався.

2. В умовах сольового стресу додавання екзогенного НПН сприяло зниженню рівня КБ за експозиції протягом 24 год. Водночас, їх рівень на 72 год був найвищий у проростків на середовищі з НПН+ NaCl.

3. Додавання в середовище НПН сприяло зниженню активності ГР та ГSТ на 72 год, підвищену в умовах сольового стресу, що може бути проявом захисної ролі оксиду азоту.

4. Активність пероксидаз, зокрема, каталази та АПО, не реагувала на жодний з ефекторів та їх комбінацію на 48 та 72 год. Проте, активність ГПО була вищою у дослідних рослин за даних умов на 72 год, тоді як на 24 год залишалась незмінною.

За результатами, представленими у даному розділі, опубліковано статтю:

Vasylyk Y. V. Effect of sodium chloride and nitroprusside on protein carbonyl groups content and antioxidant enzyme activity in leaves of corn seedlings Zea mays L. / Y. V. Vasylyk, N. M. Semchuk, O. V. Lushchak, V. I. Lushchak. // Український біохімічний журнал. –2012. – 84, № 3. – C. 82 – 87.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень

У навколишньому середовищі рослини часто піддаються дії високих концентрацій легкорозчинних солей, зокрема хлориду натрію, які поряд з осмотичним та іонним стресами зумовлюють виникнення вторинного оксидативного стресу. На даний час засолення ґрунтів займає провідне місце серед негативних екологічних факторів, оскільки згубно впливає на продуктивність сільськогосподарських культур, зокрема кукурудзи.

За дії стресових факторів зростає кількість активованих форм кисню, які відіграють важливу роль у метаболізмі рослин. З одного боку, накопичення АФК та продуктів окислення під впливом несприятливих факторів є універсальним маркером стресового стану, а з іншого, АФК за певних умов можуть слугувати регуляторами та вторинними месенджерами, що приймають участь у передачі сигнальної трансдукції. Детоксикацію АФК у клітинах рослин здійснюють антиоксидантні ферменти, активність яких підвищується за умов стресу.

У сучасних роботах, присвячених вивченню біохімічних процесів у різних рослинних організмах за умов сольового стресу, таких як кукурудза [Куриленко і Палладіна, 2001, Куриленко і Палладіна, 2005], водорості (Dunaliella salina) [Алиева и др., 2009] та цитрусові [Tanou et al., 2009] та ін. не виявлено однозначних закономірностей змін перебігу білкового та ліпідного окислення, стан фотосинтетичного апарату та функціонування антиоксидантних ферментів. Крім того, й досі залишається мало дослідженою роль донорів оксиду азоту у процесах адаптації до умов засолення та можливість їх регуляції, за допомогою препаратів, що вивільняють даний оксид.

Для того, щоб зрозуміти, які компенсаційні механізми задіяні у знешкодженні АФК при підвищенні концентрації хлориду натрію у живильному середовищі та яку роль відіграє оксиду азоту у цих умов, було досліджено розвиток проростків кукурудзи, концентрацію пігментів, маркерів окисного пошкодження білків та ліпідів, а також активність антиоксидантних ферментів у листках проростків кукурудзи.

В результаті досліджень було встановлено, що за умов росту на середовищі з високими концентраціями хлориду натрію, зокрема 100 та 200 мМ, відбувається сповільнення росту та накопичення маси пагонів кукурудзи. Також спостерігалось сповільнення росту кореня з одночасним накопиченням його маси.

Зростання концентрації хлорофілів спостерігалось на 24 год експозиції до 100 та 200 мМ NaCl. Зростання даного параметру за дії сольового стресу може бути пов’язане із різкою втратою води, тобто відбувається їх концентрування. Зростання їх концентрації також спостерігалось за дії нітропрусиду натрію протягом 24 год, що може бути зумовлено адаптивною відповіддю рослини до змін у зовнішньому середовищі або наявністю йонів заліза у складі даної солі. При сумісній дії хлориду та нітропрусиду натрію зростання концентрації хлорофілів не спостерігалось.

За дії 100 та 200 мМ NaCl також спостерігалось зростання концентрації каротиноїдів та антоціанів на 24 год. Нітропрусид натрію також призводив до зростання даного параметру. Однак при їх одночасній дії на проростки вміст даних пігментів не відрізнявся від контрольних значень. Оскільки каротиноїди та антоціани є компонентами неферментативної антиоксидантної системи в рослинних організмах, то зростання їх вмісту під час змін у навколишньому середовищі може свідчити про функціонування компенсаторних механізмів при знешкодженні АФК на “критичній” першій стадії адаптації до цих умов.

Зростання концентрації АФК за дії 50, 100 та 200 мМ NaCl призводила до зростання вмісту ТБК-активних продуктів після 24 год експозиції. Водночас, на 48 та 72 год відбувалось зниження їх вмісту при обробці хлоридом натрію до рівня контрольних значень. Зниження вмісту ТБКАП також спостерігалось на 48 год при експозиції до 0,2 мМ НПН та поєднанні 0,2 мМ НПН з 100 мМ NaCl. Зменшення концентрації вторинних продуктів перекисного окислення за дії тривалішого сольового впливу може бути наслідком окислення ненасичених жирних кислот фосфоліпідів мембран до кінцевих продуктів (ліпофусцинових сполук). Крім того, компоненти ТБК-активних продуктів, малоновий діальдегід та 4-гідроксиноненал, здатні утворювати аддукти з нуклеїновими кислотами за стресових умов [Halliwell and Gutteridge, 1989].

За умов сольового стресу спостерігалось підвищення вмісту карбонільних груп білків. Експозиція до нітропрусиду натрію показала протилежну динаміку і призводила до зниження їх концентрації. Інкубація проростків одночасно з NaCl та НПН також показала зростання вмісту КБ. Тобто, було встановлено, що сольовий стрес викликає істотне посилення процесів перекисного окислення білків та ліпідів, причому ступінь окисної деструкції залежить від концентрації NaCl та тривалості дії стресового чинника. Нітропрусид натрію навпаки пригнічує окисні процеси, проте в умовах сольового стресу інтенсивність окисних пошкоджень більків все ще залишалася вищою від контрольних значень.

При дослідженні вмісту тіольних сполук було встановлено, що вміст загальних, високо- та низькомолекулярних тіолів знижувався за дії двох найвищих використаних концентрацій NaCl (100 та 200 мМ) протягом трьох діб порівняно до контролю. Так різниця у концентрації тіолів могла бути викликана зміною кількісного і якісного складу білків. Зокрема було показано, що за умов сольового стресу відбувається зміна білкового складу у хлоропластах проростків кукурудзи [Zörb, 2009], а також в рослинах Аrabidopsis thaliana і Thellungiella halophila [Pang, 2010].

Активність гваяколпероксидази зростала у листках проростків кукурудзи за дії 100 та 200 мМ NaCl протягом 24 та 48 год. Водночас, активність каталази зростала лише на 48 та 72 год при експозиції проростків до 50 мМ NaCl. Активація активності гваяколпероксидази може бути спричинена тим, що за умов сольового стресу зростає кількість пероксиду водню [Алиева и др., 2009]. Причиною низької активності каталази щодо контрольного варіанту протягом перших діб дії високих концентрацій NaCl (100 та 200 мМ) може бути підвищення концентрації АФК, які здатні безпосередньо впливати на білок ферменту [Колупаєв, 2001]. Крім того, зниження активності каталази у листках за умов сольового стресу може відбуватися також через запобігання синтезу білку каталази або його фотоінактивації [Lee et al., 2001]. Нітропрусид натрію різних концентрацій призводив до зростання активності аскорбатпероксидази, зниження активності гваяколпероксидази, однак, не впливав на активність каталази на 24 год. Одночасна дія НПН та NaCl на 24 год призводила до зростання активності каталази, водночас, активність ГПР зростала лише на 72 год за дії обох ефекторів (НПН та NaCl) окремо, а також їх поєднанні. Підвищена активність антиоксидантних ферментів може свідчити про відповідь рослин на оксидативний стрес низької інтенсивності [Smirnoff, 1995; Lushchak, 2011].

Зростання активності глютатіон-S-трансферази та глютатіонредуктази було отримане на 24 год. Активність ГSТ також вищою зростала при експозиції до НПН+NaCl на 48 год. Це може бути пояснене тим, що оксид азоту активує експресію ГSТ генів у рослин [Delledonne et al., 1998, Durner et al., 1998]. Зростання активності ГР на 72 год за дії 100 мМ NaCl, також узгоджується з даними літератури [Uchida et al., 2002, Tanou et al., 2009].

Таким чином, проведені нами дослідження продемонстрували залежність окисних процесів білків та ліпідів, а також функціонування антиоксидантних ферментів у листках проростків кукурудзи від терміну впливу NaCl та його концентрації, а також нівелюючи дію нітропрусиду натрію за умов засолення.

Результати дисертаційної роботи можна відобразити у вигляді наступної схеми (рис. 3.31). З даної схеми видно, що сольовий стрес сповільнював ріст та накопичення маси пагона проростків кукурудзи. Це могло бути пов’язане із різкою втратою води, що в свою чергу призводило до сконцентрування пігментів. Відомо, що хлоропласти є одним з головних джерел активованих форм кисню, тобто, при збільшенні концентрації хлорофілів зростає рівень АФК. Підвищення кількості АФК призводить до підвищення вмісту тіобарбітурат-активних продуктів та зростання активності антиоксидантних ферментів. Додаванання нітропрусиду натрію, який використовують в якості донора оксиду азоту, попереджувало зростання вмісту пігментів, що призвело до зниження вмісту ТБКАП та зниження активності ферментів до контрольних значень. Отже, додавання нітропрусиду натрію пом’якшувало токсичну дію сольового стресу у проростках кукурудзи.

Рис. 3.31. Узагальнююча схема проведеного дослідження. Використані скорочення: ↑ або ↓ – зростання або зниження активності (концентрації) параметру, ־ – зниження показника до контрольного рівня, NaCl – хлорид натрію, ^•NO – оксид азоту, АФК – активовані форми кисню, ТБКАП – тіобарбітурат-активні продукти, КБ – карбонільні групи білків, ГПО – гваяколпероксидаза, Г-S-Т – глютатіон-S-трансфераза, ГР – глютатіонредуктаза.