3.3.3. Концентрація тіобарбітурат-активних продуктів
Інтенсивність процесів пероксидного окислення ліпідів є важливим показником ступеня впливу несприятливих факторів на функціональний стан рослинного організму. Так, інкубація проростків кукурудзи протягом 24 год з 0,2 мМ НПН, 100 мM NaCl, та їх комбінація не впливала на рівень ТБК-активних продуктів (рис. 3.24).
Проте, на 48 год експозиції відбувалось зниження даного показника за дії як 0,2 мМ НПН, так і 100 мM NaCl. Оскільки обидва ефектори знижували вміст ТБКАП, то їх комбінація призводила до ще більшого зниження їх вмісту і становила 43% порівняно з контрольною групою.
Попередні дослідження показали, що передобробка насіння кукурудзи 0,1 мМ НПН протягом 3 год також призводила до зниження концентрації ТБКАП за дії хлориду міді протягом 48 год [Hu et al., 2007].
Отримані результати підтверджують здатність НПН, як донора •NO, при низьких концентраціях діяти безпосередньо як антиоксидант, нейтралізуючи надлишок пероксиду водню та інших АФК [Lamattina et al., 2003], сповільнювати інтенсивність перокисного окислення ліпідів [Дубовская, 2007].
Рис. 3.24. Концентрація ТБК-активних продуктів у листках проростків кукурудзи під час експозиції з хлоридом натрію (100 мМ) та нітропрусидом натрію (0,2 мМ) протягом 24, 48 та 72 год. *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з НПН та NaCl), # НПН та ♣ NaCl груп з Р < 0,05 (n = 7-9).
Зниження концентрації ТБКАП на 17% спостерігалось за дії лише 100 мM NaCl на 72 год. Проте, коли проростки кукурудзи інкубували з нітропрусидом та хлоридом натрію одночасно, рівень ТБКАП не відрізнявся від контрольного значення. Тобто, нітропрусид натрію в даному випадку також попереджував зміни, спричинені хлоридом натрію. Ці дані відмінні від результатів, отриманих Zhang та колегами [Zhang et al., 2008]. Вони показали, що 0,1 мМ НПН не впливав на концентрацію малонового диальдегіду на 2 та 4 добу в листках проростків пшениці. Ця розбіжність може бути пов’язана з тим, що у експериментах були використані різні рослинні об’єкти. Зростання концентрації ТБК-активних продуктів також була показана Куриленко та Палладіною на проростках кукурудзи, експонованих до хлориду натрію [Kуриленко та Палладіна, 2001].
Відомо, що стресові фактори можуть викликати активацію фосфоліпази А2, яка вивільняє з мембранного бішару ненасичені жирні кислоти, які піддаються окисному руйнуванню. З іншого боку, це може бути пов’язано з низькою активністю ферментів антиоксидантного захисту, яка зумовлена ацидозом, характерним для початкових стадій клітинного пошкодження [Колупаєв, 2001].
3.3.4. Вміст карбонільних груп білків
Утворення додаткових карбонільних груп білків є результатом окисної модифікації аргініну, цистеїну, проліну, лізину, гістидину та інших амінокислотних залишків і часто використовується як показник оксидативного стресу [Tanou et al., 2009, Lushchak and Bagnyukova, 2007, Shulaev and Oliver, 2006].
Зростання концентрації карбонільних груп білків на 58% спостерігалась на 24 год експозиції до 100 мМ NaCl порівняно з контрольними значеннями у листках проростків кукурудзи (рис. 3.25).
Подібні результати були отримані Tanou та колегами [Tanou et al., 2009]. Вони показали, що при експозиції рослин лимону до 150 мМ NaCl протягом 16 год відбувалось зростання концентрації карбонільних груп білків.
Водночас, 0,2 мМ НПН не впливав на концентрацію КБ, однак при додаванні обох речовин, НПН та NaCl, разом концентрація КБ була вищою порівняно як до контролю, так і до групи, експонованої з НПН. Отже, подібно до пігментів, на першій стадії інкубації, тобто на 24 год, додавання нітропрусиду натрію частково нейтралізовувало вплив сольового стресу на проростки кукурудзи.
Рис. 3.25. Концентрація карбонільних груп білків у листках проростків кукурудзи під час експозиції з хлоридом натрію (100 мМ) та нітропрусидом натрію (0,2 мМ) протягом 24, 48 та 72 год. *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з НПН та NaCl), # НПН та ♣ NaCl груп з P < 0,05 (n = 7-9).
Тенденція до зниження концентрації карбонільних груп білків спостерігалась за дії 0,2 мМ НПН або 100 мM NaCl на 48 год, в той час як їх комбінація знижувала даний показник на 43% порівняно до контрольних значень.
Також концентрація КБ не змінювалась при експозиції до 0,2 мМ НПН або 100 мM NaCl окремо на 72 год. Водночас, їх комбінація призводила до зростання даного параметру на 45% порівняно до контролю на третю добу експозиції.
Неоднозначний ефект в даному випадку може бути зумовлений відмінностіями у дії НПН на різних етепах адаптації рослин до стресу. Підвищення вмісту КБ свідчить про посилення окисних пошкоджень білків вільними радикалами, тоді як зниження даного показника може бути зумовлене інтенсифікацією процесів деградації пошкоджених білків [Møller et al., 2007].
3.3.5. Активність ферментів, які знешкоджують АФК, та ферментів аскорбат-глютатіонового циклу
У попередженні окисних пошкоджень при підвищенні концентрації АФК задіяні низькомолекулярні антиоксиданти та ферменти антиоксидантного захисту [Foyer and Noctor, 2009]. В умовах неефективного функціонування низькомолекулярних антиоксидантів, ферменти антиоксидантного захисту можуть бути основним механізмом знешкодження АФК.
Було досліджено вплив досліджуваних речовин на активність каталази. Так, активність каталази була вищою на 57% лише при обробці 0,2 мМ НПН та 100 мM NaCl одночасно порівняно до проростків, оброблених лише 0,2 мМ НПН (рис. 3.26).
Рис. 3.26. Активність каталази у листках проростків кукурудзи під час експозиції з хлоридом натрію (100 мМ) та нітропрусидом натрію (0,2 мМ) протягом 24, 48 та 72 год. #Вірогідно відмінне від відповідних значень НПН групи з P < 0,05 (n = 7-9).
Подібні результати були отримані в тканинах калюсу бавовни [Vital et al., 2008]. Так, додавання 0,2 мМ НПН до 150 мМ NaCl достовірно підвищувало активність каталази відносно експозиції до 150 мM NaCl через 2 год у даного об’єкта дослідження.
Далі було досліджено вплив даних ефекторів протягом тривалішої експозиції. Однак, активність каталази не змінювалась за дії як 0,2 мМ НПН та 100 мМ NaCl, так і їх комбінації на 48 та 72 год.
Протилежні результати, отримані раніше, показали, що обробка 100 мМ НПН підвищувала активність каталази, а 150 мМ NaCl або комбінація NaCl та НПН знижували каталазну активність порівняно до контролю після 16 год експозиції у рослинах лимону [Tanou et al., 2009]. Куриленко та Палладіна показали, що у проростках кукурудзи експозиція до 100 мM NaCl знижує активність каталази вже після 3 год, однак на 10 добу активність каталази була нижчою порівняно до конрольної групі [Куриленко і Палладіна, 2001]. Автори вважають, що зростання активності каталази може відбуватися за рахунок посилення синтезу білку ферменту de novo, змін його ізоформ та/або модифікації його існуючих молекул.
Пероксидази, зокрема, аскорбатпероксидаза (АПО) та гваякопероксидаза (ГПО), дуже важливі компоненти антиоксидантної системи. Тому далі нами було досліджено активність цих двох ферментв. Так, було показано, що обробка проростків кукурудзи 0,2 мМ НПН протягом 24 год підвищувала активність аскорбатпероксидази у листках на 47%. Проте, ні обробка 100 мM NaCl, ні поєднання НПН+NaCl не призводило до зміни активності даного ферменту (рис. 3.27).
Триваліша інкубація проростків протягом 48 та 72 год не впливала на активність АПО. Підвищення активності АПО було отримане на проростках рису при обробці 0,1 мМ НПН протягом 2 год [Uchida et al., 2002]. Проте, попередня обробка насіння кукурудзи 0,1 мМ НПН протягом 3 год не призводила до змін активності АПО за дії хлориду міді протягом 24 та 48 год [Hu et al., 2007]. Іншими вченими було представлено результати обробки проростків пшениці 0,2 мМ НПН протягом 7 діб та показано, що така експозиція призводила до активації антиоксидантних ферментів за дії посухи, УФ-В радіації, або комбінованого стресу [Tian and Lei, 2007].
Рис. 3.27. Активність аскорбатпероксидази у листках проростків кукурудзи під час експозиції з хлоридом натрію (100 мМ) та нітропрусидом натрію (0,2 мМ) протягом 24, 48 та 72 год. *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з НПН та NaCl) та # НПН груп з P < 0,05 (n = 7-9).
При дослідженні активності гваякопероксидази (ГПО) нами було виявлено, що експозиція проростків кукурудзи до 0,2 мМ НПН або 100 мM NaCl, а також їх комбінація протягом 24 та 48 год не впливала на її активність (рис. 3.28). Проте, при збільшенні часу експозиції до 72 год достовірно підвищувала активність даного ферменту на 43, 42 та 40% при інкубації з 0,2 мМ НПН, 100 мM NaCl або їх комбінації відповідно до контролю, хоча різниці між зазначеними групами не спостерігалось. Результати інших дослідників показали, що у тканинах калюсу бавовни при додаванні 0,2 мМ НПН до 150 мM NaCl після 2 год інкубації відбувалось достовірне зростання активності ГПО порівняно до групи, обробленої лише 150 мM NaCl [Vital et al., 2008]. Зростання пероксидазної активності також була відмічена при експозиції проростків рису до 1 мкМ НПН протягом двох днів [Uchida et al., 2002].
Рис. 3.28. Активність гваяколпероксидази у листках проростків кукурудзи під час експозиції з хлоридом натрію (100 мМ) та нітропрусидом натрію (0,2 мМ) протягом 24, 48 та 72 год. *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з НПН та NaCl) групи з P < 0,05 (n = 9).
Підтримання прооксидантно-антиоксидантної рівноваги за умов сольового стресу відбувається за участі пероксидази [Куриленко та Палладіна, 2005]. Крім того, у знешкодженні АФК, що утворюються при сольовому стресі, беруть участь й інші ферменти – супероксиддисмутаза та ферменти аскорбат-глутатіонового циклу [Lee et al., 2001]. Висока активність пероксидази у листках проростків поряд із низькою активністю каталази за умов сольового стресу вказує на важливу роль першого з цих ферментів в детоксикації пероксиду водню в листках. Таке зростання активності пероксидази може відбуватися за рахунок посилення синтезу білку ферменту de novo, змін його ізоформ та/або модифікації його існуючих молекул [Куриленко та Палладіна, 2001]. Крім того, воно може бути результатом змін механічних властивостей клітинних стінок, які відбуваються при адаптації рослини до умов засолення [Куриленко та Палладіна, 2005, Harinasut et al., 2003].
Глютатіон та функціонально пов’язані з ним ферменти, такі як глютатіон-S-трансферази та глютатіонредуктаза, беруть активну участь у формуванні редокс статусу у рослин [Tausz et al., 2004]. При дослідженні активності глютатіон-S-трансферази за її НПН, NaCl або НПН+NaCl достовірних змін порівняно до контрольної групи на 24 год не було виявлено у листках проростків кукурудзи (рис. 3.29).
Рис. 3.29. Активність глютатіон-S-трансферази у листках проростків кукурудзи під час експозиції з хлоридом натрію (100 мМ) та нітропрусидом натрію (0,2 мМ) протягом 24, 48 та 72 год. *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з НПН та NaCl) та # НПН груп з P < 0,05 (n = 7-9).
Проте, зростання активності ГSТ на 54% було виявлене за дії обох ефекторів (НПН+NaCl) на 48 год, в той час як окремо дані речовини не викликали достовірних змін активності цього ферменту.
За дії тривалішої експозиції до 100 мM NaCl було показано зростання активності ГSТ на 58% порівняно до контрольної, і на 35% порівняно до групи, обробленої нітропрусидом натрію. Водночас, обробка проростків кукурудзи НПН+NaCl не призводила до зростання активності даного ферменту. Це може свідчити про захисну роль нітропрусиду натрію, оскільки його додавання знизило активність даного ферменту до контрольного рівню. З літературних джерел відомо, що додавання оксиду азоту призводить до стимулювання експресі генів ГSТ у рослинах сої [Delledonne et al., 1998] та тютюну [Durner et al., 1998] за дії патогенів на рослини.
Рис. 3.30. Активність глютатіонредуктази у листках проростків кукурудзи під час експозиції з хлоридом натрію (100 мМ) та нітропрусидом натрію (0,2 мМ) протягом 24, 48 та 72 год. *Вірогідно відмінне від відповідних значень контрольної (без інкубації з НПН та NaCl) та # НПН груп з P < 0,05 (n = 7-9).
Подібно до глютатіон-S-трансферази, активність глютатіонредуктази не змінювалась на 24 год експозицію до НПН, NaCl та НПН+NaCl (рис. 3.30). Виняток становила експозиція проростків до комбінації НПН+NaCl, яка призводила до зростання активності ГР на 28% порівняно до групи, обробленої лише 0,2 мМ НПН на 24 год. Триваліша експозиція (48 та 72 год) також практично не впливала на активність ГSТ, за винятком впливу 100 мM NaCl, який призводив до зростання активності даного ферменту на 72 год порівняно до контролю.
Подібні дані були отримані групою дослідників, які продемонстрували достовірне зниження активності ГР при додаванні 0,2 мМ НПН до 150 мM NaCl порівняно до групи, експонованої до 150 мM NaCl протягом 48 год на калюсі бавовни [Vital et al., 2008]. Інша група дослідників показала, що експозиція до 0,1 мМ НПН разом з 150 мM NaCl призводила до зростання активності глютатіонредуктази у листках цитрусових після 48 год порівняно до контролю [Tanou et al., 2009].